C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

Todos los procedimientos que utilizan los sujetos animales han estado de acuerdo con las normas del Instituto de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Western Michigan. 1. Los animales <ol><li> Usar ratas macho y hembra de 3 meses de edad en este estudio. </li><li> Mantener a los animales en un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad, con acceso libre a comida y agua. </li></ol> 2. Preparación de KAX Cocktail para anestesia animales <ol><li> Disolver 50 mg de xilazina (20 mg / ml) en 5 ml de ketamina (100 mg / ml) con 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) y 3 ml de agua destilada. Mezclar bien. </li><li> Esterilizar con un filtro de jeringa y almacenar esta solución en una botella de suero de 10 ml. </li></ol> 3. Inyección KAX <ol><li> Pesar animales (g) y volver a la jaula hasta que esté listo para la inyección. </li><li> Inyectar 0,1 ml KAX / 100 g de peso corporal de los animales por vía intraperitoneal, usando una jeringa de 1 ml de insulina con una aguja de 28 G. </li><li> Permitirpara animales de pérdida de conocimiento. Compruebe reflejos pellizcando los pies y la cola. </li><li> Mantenga todos los animales de forma segura en el laboratorio para la duración de la cirugía. </li><li> Después de la cirugía, en lugar de los animales en sus jaulas y se mantiene cómodo en TA hasta que se recupere la conciencia. Sólo los animales regresar a las instalaciones cuando los animales se despiertan y reanudar un comportamiento normal. </li></ol> 4. Preparación para la cirugía y la Asamblea de Microneedle <ol><li> Hacer una solución estéril 2 M NaCl. </li><li> Al usar un extractor de microelectrodos (Figura 1C) para tirar de un diámetro interior de 0,86 mm estándar de pulido pesado y tubo de borosilicato de pared fina en dos microagujas de vidrio finamente cónicos (Figura 1D, 1E Figura). </li><li> Rellene una microaguja de la etapa anterior con 2 M de solución salina usando una aguja de jeringa de relleno y una jeringa de 1 ml (Figura 1B). Toque las burbujas de aire de la punta del electrodo. </li><li> Llene una segunda jeringa de 1 ml con 2 MNaCl. Conectar una aguja de 18 G y luego coloque una longitud (aproximadamente 10 pulgadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilice el émbolo de la jeringa para llenar el tubo de polietileno con solución salina a través de la aguja. </li><li> Cuando tanto la microaguja y el tubo se llena con solución salina, conecte cuidadosamente los dos. Eliminar el aire en la conexión entre ellos (Figura 2). </li><li> Finamente biselar la punta de la microaguja raspando muy a la ligera a contrapelo de una toalla de papel por supuesto. </li><li> Comprobar la resistencia de la microaguja empujando suavemente el émbolo de la jeringa hasta que un fino chorro de líquido se puede ver en la toalla de papel. La corriente de líquido no debe ser más ancha que 0,5 mm. </li></ol> 5. Preparación de los Animales <ol><li> Aplicar 1 - 2 gotas de anestesia tópica a la córnea (Proparacaína Solución Oftálmica clorhidrato, USP, 0,5%). Esperar hasta que se produzca ningún reflejo ocular. </li><li> Recortar los bigotes con unas tijeras. </li><li> Saturate un aplicador con punta de algodón con solución de betadine y el área hisopo alrededor del ojo experimental. </li><li> Usando un microscopio, adjuntar una pinza hemostática para sujetar el párpado inferior para sobresalir del ojo, exponer la vena episcleral y restringir el movimiento de los ojos. (Figura 3, punta de flecha) </li></ol> 6. Glaucoma inductor de inyección de solución salina <ol><li> Cuando se preparan el conjunto de microagujas y el animal, comenzar las inyecciones. </li><li> Cuando el animal se confirmó que no responden a la pizca pies / cola, perforar cuidadosamente la vena epiescleral con la microaguja al venir en un ángulo de entre 10 y 20 grados a la vena (Figura 3, flecha blanca). Una punción éxito en la vena es evidente cuando la sangre entra en la punta de la microaguja (Figura 3, flecha negro). </li><li> Poco a poco y de forma manual inyectar aproximadamente 50 l de solución salina en la vena. Esto debe tomar aproximadamente 10 seg. Las venas se blanquean blanco como la sal circula excelentes referenciasuf la vasculatura (Figura 4, punta de flecha). Algunas regiones pueden mantener una apariencia de glóbulos rojos (Figura 4, flecha). <ol><li> Realizar una segunda inyección en la vena, frente al sitio de la primera, para asegurar daño en la retina a fondo para la capa de células ganglionares de la retina completa. Nota: En cuestión de minutos, uno debería ver un aspecto turbio distinta a través del iris del ojo como la sal circula a través del sistema vascular. </li></ol></li><li> Deje el ojo opuesto no tratada para su uso como un control interno. </li></ol> 7. Recuperación de Animales <ol><li> Retire la pinza hemostática. </li><li> Use un hisopo de algodón para aplicar el ungüento antibiótico triple (bacitracina de zinc, sulfato de neomicina, sulfato de polymysin B) al sitio sujeta por la pinza hemostática y de los puntos de inyección. daño a los tejidos alrededor del ojo no se produce utilizando la pinza hemostática. </li><li> &gt; Poner a los animales anestesiados en sus jaulas en una manta de agua caliente que circula a prevla hipotermia ent. Mantener a los animales en observación hasta que la conciencia y el comportamiento normal se recuperaron. El transporte de animales despiertos de nuevo a la colonia de animales. Los animales permanecen en la colonia hasta el momento del sacrificio. </li></ol> 8. El sacrificio de animales y la eliminación de la retina <ol><li> Un mes después del procedimiento para inducir el glaucoma, los animales son sacrificados por asfixia con CO2 y la punción torácica secundaria. <ol><li> Colocar el animal en la cámara y poner la tapa en forma segura. </li><li> Abrir las de CO 2 y el regulador de gas válvulas para permitir que el 20% de volumen / min CO2 desplazamiento de oxígeno en la cámara. </li><li> Permitir cuatro a 5 min para el animal a punto de expirar. </li><li> Desactivar las dos válvulas. </li><li> Eliminar los animales de la cámara y realizar una punción torácica secundaria con un bisturí estéril. </li></ol></li><li> Después de la eutanasia, utilizar un bisturí para cortar el tejido conectivo en la cavidad orbital que rodea el ojo, being cuidado de no cortar en el propio globo ocular. </li><li> Con cuidado, usar tijeras de borde curvado para cortar el nervio óptico y cualquier tejido restante para extraer el globo ocular intacta. Coloque globo ocular extraída en un 60 mm x 15 mm placa de Petri estéril desechable que contiene PBS fresca. </li><li> Hacer una ojera del globo ocular. Para ello, hacer una pequeña incisión con el bisturí justo posterior a la frontera entre el iris y la esclerótica. Siga esta incisión alrededor de la circunferencia del ojo con pequeñas tijeras de primavera para eliminar el hemisferio corneal del globo ocular. El hemisferio conectado al nervio óptico permanece. </li><li> Encuentra la retina muy fina de color rosa / amarillento dentro del ocular del animal sacrificado. Mantenga la capa pigmentada de la retina con unas pinzas de punta roma para estabilizar la ojera. Utilice otro par de pinzas cerradas para provocar muy suavemente toda la retina intacta fuera de la parte posterior del ojo. Evitar pellizcar, tirar o tirando de la retina directamente. </li><li> Utilice pequeñas tijeras para cortar la primaveraárea donde el nervio óptico está todavía unido a la retina. </li><li> Asegúrese de cortar la basura cualquier epitelio pigmentario residual o tejido de la esclerótica de la retina. </li><li> Usando una pipeta de transferencia, transferir suavemente la retina aislada a una Sylgard recubierto limpia de 35 mm x 10 mm placa de Petri que contiene PBS fresca. </li></ol> 9. Todo el montaje Retina Preparación <ol><li> Una vez en el plato Sylgard, el uso de fórceps y una aguja de cactus para fijar la retina en su lugar. Mantener la capa de células ganglionares de la retina hacia arriba y hacia abajo del nervio óptico. forma hemisférica de la retina es notable, incluso después de la fijación. La curvatura de la retina se podrán curvar hacia el techo cuando la capa de células ganglionares de la retina está en la orientación deseada. </li><li> Utilice pequeñas tijeras para cortar la retina en cuatro cuadrantes, haciendo la forma de un trébol de cuatro hojas que irradia de la cabeza del nervio óptico. </li><li> Pin de los cuadrantes de la retina con agujas de cactus adicionales para que la retina lo más plana posible withoestiramiento ut (Figura 5). </li><li> Fijar las retinas fijadas en el plato Sylgard con 3 ml de paraformaldehído al 4% O / N a temperatura ambiente. </li></ol> 10. tinción de anticuerpos de la Retina Nota: retinas manchas fijas con anticuerpos primarios y secundarios para la visualización de las neuronas de la retina (Figura 6). <ol><li> Enjuague fijos, retinas montadas en plano tres veces durante 2 minutos cada uno en PBS. </li><li> Permeabilizar las retinas con 1% de Triton X-100 con suero bovino fetal al 1% en PBS durante 60 min. </li><li> Enjuague retinas tres veces, 2 minutos cada uno, en PBS. </li><li> Enjuague dos veces con 0,1% Triton X-100 en PBS, 5 min por lavado. </li><li> Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado. </li><li> Incubar con 1% de Triton X-100 y suero bovino fetal al 1% en PBS a temperatura ambiente durante 45 min. </li><li> Enjuague dos veces con 0,1% Triton X-100 en PBS, 5 min por lavado. </li><li> Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado. </li><li> Incubar cada retina en suero bovino fetal 3 ml 1% en PBScon el ratón purificado anti-CD90 de rata / ratón CD90.1 (dilución 1: 300) O / N a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague retinas una vez con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5 min. </li><li> Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado. </li><li> Incubar cada retina en 3 ml de PBS (sin FBS) con secundario Alexa Fluor 594 de cabra anti-IgG de ratón (1: 300) O / N a TA. </li><li> Lávese las retinas con PBS liberalmente. </li><li> El uso de un microscopio de disección, retirar con cuidado las agujas de cactus de la retina. </li><li> transferir suavemente retinas en portaobjetos de microscopio con una pipeta de transferencia. Asegúrese de mantener la orientación con la capa de células ganglionares de la retina frente al techo. forma hemisférica de la retina es notable, incluso después de la fijación. La curvatura de la retina se podrán curvar hacia el techo cuando la capa de células ganglionares de la retina está en la orientación deseada. </li><li> Absorber cualquier exceso de PBS con KIMWIPE u otro material absorbente. Tenga cuidado de no absorber la retina. </li><li> Añadir 5 gotas de glicerina y ½ ½ PBS en peso como AMmedios ontaje. </li><li> Cubrir retina con cubreobjetos, evitando las burbujas de aire. </li><li> cubreobjetos seguro utilizando esmalte transparente de uñas, pegamento u otro adhesivo. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Este protocolo describe un método para inducir condiciones de glaucoma-como en un modelo de rata in vivo. Este procedimiento utiliza una inyección de solución salina hipertónica para inducir la formación de cicatrices en la malla trabecular 29, 32. El desarrollo de tejido de cicatriz ocluye el flujo de salida de humor acuoso que aumenta la presión en la cámara anterior. Con una disminución de flujo y la presión se acumulan, la lente está suspendido por ligamentos elásticos empuja de nuevo ...

El glaucoma es un grupo de enfermedades oculares que afectan a las neuronas de la retina, en concreto, las células ganglionares de la retina 1-2. Los axones de estas células convergen para convertirse en el nervio óptico lleva la información visual al cerebro donde se percibe la visión. El daño a la CGR y sus axones, por tanto, causa defectos visuales. Las características principales asociados con trastornos de glaucoma son RGC degeneración y la muerte, aumento de la presión intraocular (IOP), y cupping disco óptico y atrofia. Estas características conducen a la pérdida del campo visual o completa, la ceguera irreversible. En la actualidad, el glaucoma ha causado la ceguera en 70 millones de personas en el mundo 3. Como tal, es la tercera mayor causa mundial de ceguera 4. Se desconoce el mecanismo exacto de la muerte de CGR en el glaucoma. Muchas investigaciones se han hecho para resolver el misterio. Se sabe, sin embargo, que el principal factor de riesgo de glaucoma es un aumento in de la presión intraocular debido a la circulación irregular de humor acuoso (AH) en la cámara anterior del ojo. AH actúa como reemplazo transparente e incoloro para la sangre en la cámara anterior avascular del ojo. Nutre las células circundantes, elimina los productos de desecho secretados a partir de los procesos metabólicos, transporta los neurotransmisores, y permite la circulación de drogas y células inflamatorias dentro del ojo durante los estados patológicos 1. El mantenimiento de la circulación del humor acuoso implica el cuerpo ciliar y la malla trabecular. El humor acuoso es producido por el cuerpo ciliar. A continuación, fluye en la cámara anterior para mantener la salud general del tejido ocular. 75 a 80% de salida de humor acuoso es secretado activamente a través de epitelio ciliar no pigmentario cuando el fluido se filtra a través de tres capas de tejido esponjoso en el músculo ciliar. Las salidas de fluido a través de la malla trabecular y a través del canal de Schlemm, que adelantarseIES en el sistema sanguíneo 5 .El restante 20 a 25% del flujo de salida pasa por la malla trabecular y se pasivamente secretadas por ultrafiltración y difusión a través de la vía uveo-escleral. Esta vía parece ser relativamente independiente de la presión intraocular 1. Cuando la producción de humor acuoso y la salida están fuera de equilibrio, aumenta la presión dentro del ojo. Como se ha indicado, este aumento de la presión intraocular es el principal factor de riesgo en el desarrollo de glaucoma. Esta presión causa daño a las intrincadas capas de neuronas de la retina en la parte posterior del ojo. El daño a los axones de las células ganglionares de la retina del nervio óptico hace que el cerebro ya no recibe información visual precisa. Como resultado, la percepción de la visión se pierde y se puede producir ceguera completa. Hasta la fecha, no existe una cura para el glaucoma. Existen diferentes métodos de tratamiento que principalmente tienen como objetivo reducir la presión intraocular. Estos incluyen la administración tópicaclases de medicamentos tales como bloqueadores de los receptores beta1-adrenérgicos, o análogos de las prostaglandinas tópicas. Los bloqueadores beta reducen la presión intraocular al disminuir la producción de humor acuoso 7. Las prostaglandinas función para reducir la PIO mediante el aumento del flujo de salida de humor acuoso 8-14. agonistas adrenérgicos alfa y los inhibidores de la anhidrasa carbónica se utilizan también como métodos secundarios de tratamiento. Agonistas alfa adrenérgicos aumentan flujo de salida a través de la vía uveoescleral 15-17. Inhibidores de la anhidrasa carbónica reducen la producción de AH por la inhibición enzimática 18. Mucho más procedimientos invasivos también están siendo utilizados para tratar el glaucoma. Trabeculoplastia láser se utiliza para aumentar el flujo de salida del humor acuoso 19. Otra terapia quirúrgica, llamada trabeculectomía, crea un sitio de drenaje alternativo para filtrar AH cuando la vía trabecular tradicional es bloqueado 20-21. Estas opciones de tratamiento han sido conocidos por efcaz reducir la PIO. Sin embargo, hasta el 40% de los pacientes con glaucoma muestran niveles normales de PIO que indican una necesidad de procedimientos terapéuticos más completos. 22,23 Además, la muerte de células ganglionares de la retina se ve en el glaucoma es irreversible una vez que comienza y los tratamientos actuales no se detienen la progresión de la enfermedad 24-28. Esto ha puesto de relieve la necesidad de tratamientos neuroprotectores eficaces destinadas a la supervivencia de las neuronas mismas. Desarrollo de modelos de glaucoma es crucial para este desarrollo. En este estudio estamos demostrando un método de inducir efectos glaucoma-como en ratas Long Evans adultas utilizando un procedimiento modificado descrito originalmente por Morrison 29. En este procedimiento, las inyecciones de 2 M de solución salina hipertónica en el plexo venoso episcleral induce condiciones glaucoma-como por la cicatrización de tejido para reducir la salida de humor acuoso en la malla trabecular que conduce a un aumento de la presión intraocular y una pérdida significativa de CGR wentro de un mes tras el procedimiento 30-31. procedimientos de inducción de glaucoma, tales como la descrita aquí, puede ser la clave para desbloquear los nuevos avances en los tratamientos para el glaucoma.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

El glaucoma es una enfermedad del sistema nervioso central que afecta a las células ganglionares de la retina (CGR). RGC axones que forman el nervio óptico llevan la información visual al cerebro para su percepción visual. El daño a la CGR y sus axones conduce a la pérdida de la visión y / o ceguera. Aunque la causa específica del glaucoma es desconocido, el principal factor de riesgo para la enfermedad es una presión intraocular elevada. procedimientos de inducción de glaucoma en modelos animales son una herramienta valiosa para los investigadores que estudian el mecanismo de la muerte de CGR. Dicha información puede conducir al desarrollo de tratamientos neuroprotectores eficaces que podrían ayudar en la prevención de la pérdida de la visión. El protocolo en este documento se describe un método para inducir el glaucoma - al igual que las condiciones en un modelo de rata in vivo en 50 l de 2 M de solución salina hipertónica se inyecta en el plexo venoso epiescleral. El blanqueo de los vasos indica inyección con éxito. Este procedimiento provoca la pérdida de la CGR para simular el glaucoma. Un mes siguienteinyección, los animales son sacrificados y los ojos son removidos. A continuación, la córnea, el cristalino y vítreo se retiran para hacer una ojera. La retina se desprende entonces de la parte posterior del ojo y inmovilizó en placas de Sylgard con agujas de cactus. En este punto, las neuronas de la retina se pueden teñir para su análisis. Los resultados de esta práctica de laboratorio muestran que aproximadamente el 25% de la CGR se pierden dentro de un mes del procedimiento en comparación con los controles internos. Este procedimiento permite el análisis cuantitativo de la muerte de células ganglionares de la retina en un modelo de rata in vivo glaucoma.

Esta sección ilustra los componentes del aparato y el procedimiento utilizado para inducir condiciones glaucoma-como en una rata modelo de glaucoma in vivo. Mostramos las herramientas individuales y el equipo utilizado para realizar una inyección de solución salina hipertónica que provoca un aumento en la presión intraocular. Mostramos la inyección en el plexo venoso epiescleral con su característico efecto de blanqueo y el aspecto turbio de la cámara anterior que result...

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K vistas.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Video: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Investigación

Neurociencias

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Bioingeniería

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Medicina

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

El modelo de roedor de la anterior no arterítica neuropatía óptica isquémica (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Evaluación fisiopatológica de la retina en un modelo de rata

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Biología

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. Accessing the rat optic nerve for experimental manipulations and injections is challenging due to the small size of the orbit and the vascularity of the surrounding orbital tissues. Previous techniques have involved a cutaneous incision, which carries a higher risk of infection and requires wound closure. This study aims to describe a unique, less invasive, and potentially more efficient approach to accessing the rat optic nerve. A transconjunctival incision, along with a rat spinal cord hook, is used to isolate the optic nerve for experimental injections. In these experiments, an adenoviral vector is injected into the optic nerve with the goal of using this technique for direct gene therapy delivery in the future. This technique can also be applied by investigators requiring access to the rat optic nerve for other experimental studies, including drug delivery and optic nerve injury research.

This protocol describes a unique technique using a transconjunctival approach to access the rat optic nerve for injections.

Abordaje transconjuntival para inyección en el nervio óptico de la rata

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

Una técnica de inyección de solución salina hipertónica para inducir glaucoma en ratas

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Glaucoma de inducir en un Procedimiento

Resumen

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