Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIAID AI45889 subvención a SAP de citometría de flujo estudios se llevaron a cabo utilizando las instalaciones centrales de FACS apoyados por el Centro de Cáncer de Einstein (NIH / NCI CA013330) y el Centro para la Investigación del SIDA (NIH / NIAID AI51519).

Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices aprobadas por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el uso (IACUC). Todos los procedimientos que requieren la esterilidad se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad. 1. Implantación de B16.Flt3L melanoma en ratones <ol><li> Cultura la expresión de línea de Flt-3 B16 melanoma celular en T25 matraces de cultivo tisular a una densidad de 0,5 x 10 6 células / ml en medio completo DMEM con 10% de CO2 a 37 ° C. Creciendo hasta que las células alcanzan ~ 90% de confluencia (~ 20 h). </li><li> Recoger las células por digestión con tripsina. Aspirar los medios de cultivo celular y se lavan las células adherentes con PBS. Añadir 5 ml de tripsina al 0,05% y se incuba durante 5 min a 37 ° C. Añadir 20 ml fríos medio completo DMEM (4 ° C) que contiene suero de ternera fetal (FCS) para extinguir la digestión con proteasas. Levantar las células fuera golpeando ligeramente seguido pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 300xg durante 10 min a 4 ° C. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de la viabilidad celular automatizado. Resuspender a una densidad de 10 8 células / ml en PBS. </li><li> Ratones implante (C57BL / 6 o de otra cepa histocompatible) con células tumorales mediante inyección subcutánea como se describe por Machholz et al. 19 en la base del cuello con 100 l de suspensión de células (10 7 células). </li><li> Deje que el tumor crezca hasta palpables o visibles (2 - 10 mm de diámetro, generalmente 7 - 12 días) antes de sacrificar animales para la extracción de órganos. </li></ol> 2. Preparación de esplénica suspensión de células individuales a partir de ratones portadores de tumor <ol><li> Anestesiar a los ratones con una sobredosis de isoflurano (ajuste la velocidad de flujo de isoflurano a&gt; 5% y continuar la exposición al menos 2 minutos después de dejar de respirar). Sacrificar el ratón portador de un tumor de melanoma Flt-3 por dislocación cervical según las directrices institucionales para la eutanasia. </li><li> disinfect la piel con 70% de etanol y el bazo cosecha utilizando una técnica aséptica con la ayuda de unas tijeras estériles 20. </li><li> Coloque el bazo en una placa de Petri estéril para su transporte a la cabina de bioseguridad. Realizar todos los pasos de aquí en adelante en condiciones estériles. </li><li> Transferencia de bazo a un plato fresco Petri y se lava con medio RPMI. Cortar el bazo en trozos pequeños (~ 0,2 cm 2) utilizando un bisturí. Incubar durante 30 min a 37 ° C con 10 ml de solución de colagenasa / DNasa. </li><li> Se vierte la suspensión parcialmente digerido de tejido esplénico en un filtro de células de 70 micras. Comprimir los fragmentos de tejido restante a través de la malla del filtro utilizando un émbolo de la jeringa 5 ml. </li><li> Lavar el filtro de malla con 10 ml de medio fresco y deseche el filtro. Centrifugar la suspensión a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar las células. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de lisis RBC. Se incuba a RT fo 10 min. Se detiene el tampón de lisis RBC mediante la adición de 10 ml de medio completo RPMI. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender en volumen apropiado para alcanzar la densidad celular de 10 8 células / ml en tampón de clasificación de células (por ejemplo, MACS) que contiene 20 mg / ml de anticuerpo Fc-bloque (2.4G2). </li></ol> 3. Purificación de plasmocitoide DC, DC y CD8a Pos Neg CD8a países en desarrollo de esplénica suspensión de células individuales Nota: El aislamiento de los subconjuntos de DC esplénicos de suspensión de células individuales es un procedimiento de múltiples etapas como se ilustra en la Figura 1 Realizar todos los pasos usando tampón de pre-enfriado y un baño de agua con hielo para mantener la temperatura a 4-8 ° C.. Todos los volúmenes de reactivos en el siguiente apartado del protocolo se calculan para una entrada inicial de 200 l de suspensión de células del bazo a los 10 8 células / ml). Esto se puede escalar hacia arriba o haciaabajo función de sus necesidades, cambiando el volumen de suspensión celular (siempre a una densidad de 1 x 10 8 células / ml) y otros reactivos proporcionalmente en la etapa inicial (3.1.1 y 3.2.1). Ajustar los volúmenes de reactivo en todos los pasos posteriores en consecuencia. Por ejemplo, si a partir de 100 l de suspensión de células del bazo en 1 x 10 8 / ml, utilizar la mitad de los volúmenes de reactivos indicadas en todos los pasos. <ol><li> El aislamiento de los DC plasmocitoide (PDC) <ol><li> Añadir 300 l de cóctel de anticuerpo marcado con biotina en el kit plasmocitoide aislamiento de CC a 200 l de suspensión celular esplénica. </li><li> Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. Toque en el tubo de cada 3 minutos para mantener las células en suspensión, y para maximizar la unión de los anticuerpos. </li><li> Añadir 12 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante para eliminar los anticuerpos no unidos con biotina. </li><li> Resuspender la célulaprecipitado en 500 l de tampón de clasificación de células. Añadir 300 l de perlas de anticuerpo conjugado con anti-biotina. Repita el paso 3.1.2 y 3.1.3. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de clasificación de células. Realizar todos los pasos de este punto en adelante a temperatura ambiente utilizando tampones pre-enfriado. </li><li> Coloque una célula activada magnética fresca de clasificación de columna LS en el soporte magnético. Lavar y equilibrar la columna con 5 ml de tampón de clasificación de células. </li><li> Pipetear la suspensión celular en la columna, aplicando suavemente para el centro de la superficie del lecho de la columna. Recoger el flujo a través. </li><li> Lavar la columna con 10 ml de tampón de clasificación de células. Recoger este flujo a través y se combinan con el flujo a través del paso 3.1.7. Los PDC se enriquecen en este flujo a través de la columna (FT1). </li><li> Sedimentar las células de FT1 por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, se resuspenden en 2 ml de tampón de clasificación celular y pasar las células a través de una columna LS frescorepitiendo los pasos 3.1.6 - 3.1.8. Este uso de dos columnas secuenciales produce una mayor pureza de las células aisladas. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, y resuspender con 2 ml RPMI completo. Colocar en hielo hasta que se necesite. </li></ol></li><li> Aislamiento de CD8a Pos Neg CD8a y los países en desarrollo Nota: El primer paso en este procedimiento es el agotamiento de las células B, PDC, T y NK. <ol><li> A partir de toda la suspensión de células de bazo (1 ml de 10 8 células / ml obtenidos en la etapa 2.8), añadir 100 l de cóctel de anticuerpo conjugado con biotina proporcionado en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC. </li><li> Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. Toque en el tubo suavemente cada 3 minutos para maximizar la unión de los anticuerpos marcados con biotina a sus células diana. </li><li> Añadir 12 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar súpersobrenadante para eliminar los anticuerpos no unidos con biotina. </li><li> Añadir 150 l de tampón de clasificación celular y 100 l de perlas de anti-biotina proporcionados en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. </li><li> Añadir 10 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en tampón de clasificación 1 ml de células y pasar por encima de una columna LS fresca acuerdo con el procedimiento en los pasos 3.1.6 a través de 3.1.8. </li><li> Recoger el flujo sin etiqueta a 2 (FT2) y desechar el material retenido columna. Esta fracción se enriquece sin etiqueta para CD8a Pos Neg CD8a y los países en desarrollo. </li><li> Sedimentar las células en FT2 por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en tampón de clasificación celular 1 ml y añadir 200 l de perlas magnéticas conjugadas-CD8a contra proporcionados en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC. </li><li> Repscomer pasos 3.2.2 a través de 3.2.6. El flujo a través de la columna se enriquece para CD8a Neg DC y agota para CD8a Pos países en desarrollo. Esto se denomina flujo a través de 3 (T3L). </li><li> Para eluir el CD8a Pos DCs retenido en la columna, eliminar la columna del imán, añadir 5 ml de tampón de clasificación celular y purgar la matriz de la columna usando el émbolo suministrado con la columna de LS. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender en tampón de clasificación de 1 ml de células. Para aumentar la pureza, ejecute las células eluidas de nuevo a través de una columna LS fresco repitiendo los pasos 3.1.6 a 3.1.8, excepto desechar el flujo a través y recoger células retenidas como en 3.2.11. </li><li> Para purificar el CD8a Neg DCs de la suspensión PIE3S, sedimentar los PIE3S por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender en 300 l de tampón de clasificación de células. </li><li> Añadir 100 l de mag anti-CD11cperlas néticas. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. </li><li> Añadir ordenar celdas tampón y de pellets de 10 ml de células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Repita los pasos 3.1.5 a través de 3.1.8. El CD8a Neg DCs se seleccionan positivamente con perlas de CD11c y se unió a la columna. El flujo a través se puede descartar. </li><li> La elución de las células retenidas en la columna como se describe en el paso 3.2.11 para recoger el purificada CD8a Neg DC. </li></ol></li></ol> 4. pulsante APC con antígenos y de transferencia de células <ol><li> Contar las células vivas después de la purificación mediante exclusión con azul de tripano 21 para distinguir las células vivas y muertas. </li><li> Se incuban las células con el antígeno de elección. Utilizar análogos de antígeno glicolípido ceramida llamada alfa-galactosil (αGalCer) a una concentración de 100 nM 13. Típicamente, la placa 10 6 células viables / pocillo en medio RPMI completo el uso de ultra bajo attachment de fondo en U de 96 pocillos para minimizar la unión celular. Se incuban las células en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ° C por 1 - 4 horas. </li><li> Las células de la cosecha con la pipeta suavemente varias veces. Utilice puntas de pipeta diámetro ancho para minimizar el daño celular de las fuerzas de corte. Lavar los pocillos con PBS y agrupar estos lavados para maximizar la obtención de células. </li><li> Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender a la densidad deseada en PBS. Por lo general, se inyecta 1 millón de células en 200 l por animal receptor. Mantener las células en hielo para maximizar la viabilidad antes de la administración en animales huésped. </li><li> Inyectar células vía intravenosa en ratones, ya sea a través del vano lateral de la cola o del plexo venoso retroorbital 19. Use una aguja 27 G en una jeringa de 1 ml, y se inyecta un volumen máximo de 0,1 ml por ratón. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

se aceptan las células dendríticas que es el principal antígeno profesional que presenta células que participan en el cebado de respuestas de células T. Su función principal es la de inspeccionar el microambiente del tejido mediante la adopción y el procesamiento de antígenos para la presentación a las células T. Con el fin de estudiar la función de subconjuntos específicos de DC, estos necesitan ser aislados en cantidades suficientes utilizando un enfoque que mantiene su fenotipo y las funciones normales. L...

Las células dendríticas (DC) fueron descubiertos hace casi cuarenta años como el &quot;gran estrelladas (griego dendron) celular&quot; que se encuentra en los órganos linfoides 1. Muchos estudios han demostrado que los países en desarrollo son las únicas células que presentan antígenos que pueden estimular eficazmente las células T ingenuas 2. Una función importante de estas células es la captación y presentación de antígenos y su procesamiento eficaz y la carga de éstos a las moléculas presentadoras de antígeno. En bazo de ratón, las DC se puede separar en plasmocitoide y subconjuntos convencionales. Las DCs plasmacitoides se caracterizan por una baja expresión de CD11c y altos niveles de B220 y Gr-1. Ellos también son positivas para el marcador de superficie mPDCA1 y secretan interferón de tipo I en respuesta al número 9 como ligandos del receptor (TLR9). Las CD convencionales son demasiado altos para CD11c y MHC clase II expresión. Ellos se pueden dividir en tres subconjuntos distintos basados ​​en la expresión superficial de marcadores fenotípicos tales como CD4, CD8a, DEC205, CD11b y las células dendríticas del receptor inhibitorio 2 (DCIR2, reconocido por el anticuerpo 33D1) proteínas 3,4. Los CD8a Pos DC también se conocen como Cdc1, son positivas para DEC205, pero negativas para los marcadores mieloides tales como CD11b y 33D1. El CD8a Neg DC, también llamado cdc2, son positivos para 33D1, CD11b y CD4, pero carecen de DEC205. El subgrupo negativo doble (es decir, negativo para CD4 y CD8a) es relativamente poco frecuente, y es negativa para DEC205 y 33D1. Es el subconjunto menos caracterizado y puede ser una forma menos diferenciadas de CD8a Neg DC. Las diferencias fenotípicas en los diferentes subconjuntos de DC se extienden también a sus funciones in vivo. El CD8a Neg los DC son altamente fagocítica y se cree que presentar el antígeno exógeno principalmente a través de MHC de clase II de células T CD4 3. Por el contrario, los países en desarrollo Pos CD8a son especializados para la presentación de antígeno de proteína soluble en MHC de clase Ien un mecanismo denominado presentación cruzada. El resultado de la presentación cruzada depende del estado de activación de estas DCs 5, y puede o bien conducir a la expansión de las células T citotóxicas (CTL) o el desarrollo de células T reguladoras 6 2,7. Focalización del antígeno a CD8a Pos DC usando resultados de la entrega mediada por anti-DEC205-anticuerpo en gran medida en la eliminación de las células T 8, mientras que la presentación de antígenos derivados de células apoptóticas infectadas induce una fuerte respuesta CTL 9. Además del reconocimiento de antígenos peptídicos, el sistema inmune de los mamíferos ha evolucionado para reconocer los antígenos de lípidos y glicolípidos. Estos antígenos son presentados por moléculas CD1, que son proteínas de la superficie celular-I como de clase MHC que existen en múltiples formas relacionadas en diversos mamíferos. En ratones, un solo tipo de molécula de CD1 altamente conservada llamada CD1d es responsable de la presentación de antígenos glicolípidos 10. El mayor<html> población de células T que reconocen complejos CD1d / glicolípidos se llama células NKT invariantes (células iNKT). Estas células expresan un receptor de células T semi-invariante (TCR) compuesto por una cadena invariante TCRα que se empareja con cadenas TCR que han diversidad 11 limitados. A diferencia de las células T convencionales que necesitan para proliferar y diferenciarse para convertirse en células T efectoras activadas, existen células iNKT como una población efectora y comenzar a responder rápidamente después de la administración glicolípido 12. Identificación de células presentadoras de antígeno de lípidos fisiológicamente relevante es un área activa de investigación, y se han sugerido varios tipos de células diferenciadas, tales como las células B, los macrófagos y las CD para realizar esta función. Sin embargo, se demostró que el subconjunto CD8a Pos de las DC es la célula primaria que media la captación y presentación de antígenos a las células de lípidos iNKT ratón 13 y glicolípido mediada cebado cruzado de células T CD8 14. ove_content &quot;&gt; Para comparar la eficiencia de la presentación de antígenos por diferentes células presentadoras de antígenos, un enfoque directo es la transferencia de los diferentes tipos de APCs purificadas pulsadas con cantidades equivalentes de antígeno en huéspedes tratados previamente. experimentos de transferencia de células de este tipo se realiza a menudo para estudios inmunológicos. Sin embargo, la realización de estudios de transferencia con las DC tratadas ex antígeno in vivo es un reto, ya que estas células existen poblaciones tan raros en los órganos linfoides en las que constituyen menos del 2% del total de células 15. por tanto, es necesario mejorar el desarrollo de estas células en los animales donantes para aumentar la eficacia de los protocolos de aislamiento. Se sabe que la linfoide común y progenitores mieloides comunes, que son necesarios para la generación de pDC, CD8 Pos y subconjuntos CD8 Neg DC, expresa fms relacionadas receptor tirosina quinasa 3 (Flt-3). A in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) administración, emigration de Flt-3 que expresan las células progenitoras de la médula ósea se incrementa, lo que resulta en el aumento de la siembra de los órganos linfoides periféricos y la expansión de su progenie madura DC 16. La expresión de Flt-3 se pierde durante el compromiso con el B, T o NK vías de diferenciación celular. Por lo tanto, sólo alteraciones mínimas se observan en estas células tras la administración Flt-3L. Expansión similares en las poblaciones de DC se observa en ratones con tumores generados por la implantación de una línea celular B16-melanoma secretoras de murino Flt-3L, que proporciona un método sencillo y económico para proporcionar niveles sistémicos sostenidos de Flt-3L 17,18. Usando este enfoque, hemos desarrollado un protocolo basado en la implantación de células B16 melanoma secretoras de Flt-3L para estimular la expansión de todos los subconjuntos normales de corriente continua en el bazo del ratón, lo que aumenta en gran medida los rendimientos de estas células que se pueden aislar para experimentos posteriores . constantemente nos encontramos con que dentro de 10 - 14 días después de im subcutáneaplantación del tumor secretor de Flt-3, los ratones desarrollan esplenomegalia marcada con el enriquecimiento de las DC para constituir 40 - 60% del total de células de bazo. A partir de estos bazos, diferentes subconjuntos de DC se pueden aislar con alta pureza usando el estándar kits de purificación de células disponibles en el mercado que emplean marcadores fenotípicos-subconjunto específico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (dry powder)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9-6705-004-220</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11130-051&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (dry powder)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6146-5G&#160;</td>
			<td>Prepare 0.08% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-152-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;Pos mouse DC isolation kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c-FITC&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945;-PerCP&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220-PE&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>26048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G1 needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri plates&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand MACS separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore 200 &#956;l pipette tips&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>111623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ultra-low attachment 96-well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Jackson Research Laboratories, Jax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine B16.Flt3L melanoma cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described by Mach et al. ,2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free DMEM and RPMI media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 
			 
			5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml HEPES Buffer (1 M)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml L-glutamine (200 mM)&#160; 
			 
			0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.&#160; Filter sterilize the media by passing through a 0.22 &#181;m vacuum filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI and DMEM media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase D and DNase 1 stock solution 
			Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 Units of collagenase activity per ml 
			 
			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 &#176;C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno profesionales principalmente responsable de la adquisición, procesamiento y presentación de antígenos en moléculas presentadoras de antígenos para iniciar la inmunidad mediada por células T. Las células dendríticas se pueden separar en varios subconjuntos fenotípicamente y funcionalmente heterogéneos. Tres importantes subconjuntos de células dendríticas esplénicas son plasmocitoide, células CD8a POS y CD8a Neg. Las DCs plasmacitoides son productores naturales de interferón de tipo I y son importantes para la inmunidad de células T anti-viral. El subconjunto CD8a Neg DC está especializada para MHC de clase II presentación de antígenos y está implicado en el centro de cebado de células T CD4. El CD8a Pos países en desarrollo son los principales responsables de la presentación cruzada de antígenos exógenos y sensibilización de las células T CD8. Los CD8a Pos DC han demostrado ser más eficaz en la presentación de antígenos glicolípidos por moléculas CD1d a un cel T especializadal población conocidas como células T asesinas naturales invariantes (iNKT). La administración de Flt-3 ligando aumenta la frecuencia de la migración de progenitores de células dendríticas de la médula ósea, lo que se traduce en la expansión de las células dendríticas en los órganos linfoides periféricos en modelos murinos. Hemos adaptado este modelo para purificar grandes cantidades de células dendríticas funcionales para su uso en experimentos de transferencia de células para comparar dominio in vivo de diferentes subconjuntos de DC.

El resultado de este procedimiento se basa en la expansión de los subgrupos de CD por murino Flt-3L expresado por las células de melanoma implantados. El tumor B16.Flt3L se derivó de un 6 mouse / C57BL, y debe ser implantado en animales con que cepa de antecedentes con el fin de evitar el fallo del tumor a establecerse debido al rechazo. En algunos casos, puede ser deseable usar ratones modificados genéticamente para derivar DCs con defectos conocidos en vías o receptores de interé...

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An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

an-efficient-high-yield-method-for-isolation-mouse-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K vistas.  Albert Einstein College of Medicine. Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Video: An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

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