The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne H&#233;l&#232;ne Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Los experimentos cumplen con la regulación nacional y europea sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento. 1.-montaje plana de Xenopus laevis renacuajos anterior Tubo Neural Después de todo el montaje hibridación in situ <ol><li> Obtener X. laevis embriones según los procedimientos estándar de 4 y los años hasta que alcancen neurula etapa 26 y más años (según Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17. </li><li> Fix X. laevis renacuajos mediante su incubación en una solución de 4% de paraformaldehído (PFA). Roca y rotar los embriones en un vial de vidrio de 2 ml, de 1 a 1.5 hr a RT durante la etapa 26 a la etapa 38 embriones, 2 horas a RT para los embriones en etapas posteriores. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico por contacto y un posible carcinógeno. Debe ser manipulado bajo una campana. NOTA: Uno X. laevis cría espor lo general fijado en un vial de vidrio de 2 ml, pero un vial de vidrio más grande puede ser utilizado. </li><li> Lavar los embriones en el mismo vial utilizando 1x PBS con 0,1% de Tween (PBT), 3 min a RT, dos veces. NOTA: A menos que de otro modo especificar el PBS utilizado es con o sin calcio y magnesio. </li><li> Deshidratar los embriones en 100% de metanol (MeOH) durante al menos 12 horas a RT en el mismo vial. Cambie el MeOH 100% al menos dos veces bajo el capó con una micropipeta de plástico. NOTA: El MeOH se vuelve ligeramente amarillo como lípidos disueltos en ella. Precaución al MeOH es tóxico por inhalación y debe manipularse bajo una campana. </li><li> Rehidratar los embriones utilizando el mismo vial a través de una serie graduada de baños de MeOH: MeOH 75% en PBS, MeOH 50% en PBS, MeOH 25% en PBS, PBS dos veces, cada baño de 5-10 minutos a TA. Las soluciones de MeOH se cambian bajo el capó con una micropipeta de plástico. </li><li> Usando una pipeta de plástico, la transferencia del embrión a ser disecado en una placa de Petri de 60 mm lleno hasta el tope con PBT. El uso de dos pinzas finas cuidadoeliminar totalmente los ojos mediante la inserción de uno pinzas finas entre los ojos y el tubo neural, a nivel del tallo óptico. Separe los ojos del tubo neural. Introducir con cuidado la pinza por debajo del ectodermo que recubren el tubo neural. Con cuidado, retire el ectodermo partiendo de detrás de la cabeza y lo descarta. </li><li> Realice una ISH doble o individual utilizando digoxigenina-etiquetados o sondas marcadas con fluoresceína como anteriormente descritos 18,19. </li><li> Después de la ISH transferir los embriones de un nuevo 60 mm placa de Petri llena hasta el tope con PBT con una pipeta de plástico. </li><li> Usando unas pinzas finas separar cuidadosamente el tubo neural del resto del embrión. En esta etapa, el tubo neural anterior se separa del tubo neural posterior. Separar cuidadosamente restantes partes del ectodermo que recubren el tubo neural, la notocorda que se adjunta suelta debajo del tubo neural, las vesículas óticas y restantes partes del mesodermo. Asegúrese de que el tubo neural está desprovisto de cualquier apéndiceen este punto. NOTA: Para evitar daños en el tubo neural realizar todas las transferencias de tubo / embrión neuronal con una pipeta de transferencia de plástico o una micropipeta si es necesario con un corte de punta en su extremo. El diámetro del extremo de la punta se ajusta al tamaño del tubo neural. </li><li> Transferir el tubo neural diseccionado (ver nota paso 1,9) en un tubo de 1,5 ml lleno con 50% de glicerol diluido en PBS. Espere hasta que los tubos neurales han caído a la parte inferior de la solución de glicerol, por lo general O / N a 4 ° C. </li><li> Retirar la solución de 50% de glicerol / PBS utilizando una micropipeta P1000 y añadir en el mismo tubo de 1,5 ml de una solución de 90% de glicerol / PBS utilizando una micropipeta P1000. Espere hasta que los tubos neurales caen hacia el fondo de la solución de 90% de glicerol / PBS, por lo general O / N a 4 ° C. NOTA: para almacenamiento a largo plazo, utilizar 90% de glicerol / PBS más antibióticos para prevenir el desarrollo de bacterias. </li><li> Transferir los tubos neurales en una placa de vidrio, o un portaobjetos de microscopio con una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Dissecta de los tubos neurales a lo largo de la dorsal y ventral líneas medias utilizando agujas de tungsteno. Durante ese paso de los tubos neurales se mantienen en 90% de glicerol / PBS. </li><li> Montar los dos lados del tubo neural en 90% de glicerol / PBS utilizando anillos de refuerzo cubiertos con un cubreobjetos de vidrio. </li><li> Fijar los cubreobjetos con barniz y mantener a 4 ° C. </li></ol> 2. Cap Animal explantes de inducción usando perlas de resina de intercambio de aniones <ol><li> Transferir 100 l de perlas de resina de intercambio aniónico en un tubo de 2 ml utilizando una micropipeta P1000. Lavar las perlas por lo menos cinco veces consecutivas con agua destilada estéril. Permitir que las perlas se sedimentan en la parte inferior del tubo y reemplazar el agua destilada estéril utilizando una micropipeta P1000. No toque las bolas. </li><li> Deje que los granos en remojo O / N en un tubo de 2 ml llena de agua destilada estéril con albúmina de suero bovino (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C. </li><li> Dos horas antes de la recogida de las CCAA, coloque la mitad de los granos en un nuevo 1,5 mltubo usando una micropipeta P1000. Reemplazar el agua destilada estéril con 500 l de medio que contiene la molécula a ensayar por su potencial inductivo, o sabe que inducen un destino específico. Mantenga la otra mitad de las perlas, ya que se pueden utilizar como un control negativo. </li><li> Incubar las perlas a 4 ° C durante al menos 2 hr. </li><li> Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes bajo el microscopio estereoscópico y realizar todas las transferencias de CA con una micropipeta. </li><li> Transferencia de embriones o blástula gástrula muy tempranas en PBS con calcio y magnesio complementado con 0,2% de BSA utilizando una pipeta de transferencia de plástico. NOTA: Los embriones en desarrollo a los 12 ° C blástula y gástrula etapas alcance de 20 a 24 horas. </li><li> Retirar membrana vitelina del embrión utilizando pinzas 20 como se describió anteriormente. Fijar el embrión con uno fórceps. Pellizcar la membrana vitelina con el lado de las otras pinzas. La celebración de la membrana, lentamente despegarlo del embrión. Realice este procedimiento en la venlado del embrión tral (vegetal). No dañe el lado animal del embrión. </li><li> Aislar pequeñas CCAA como se describió anteriormente 21. El polo animal es parte pigmentada del embrión. Usando unas pinzas finas cortan un pequeño cuadrado de tejido fuera del polo animal. El tejido AC contiene sólo las células ectodérmicas. Asegúrese de que el tejido es de espesor uniforme. Si no es así, retire la AC del análisis. </li><li> Coloque cada CA en unos Terasaki placas de múltiples pocillos en 0.5x modificados de Barth salinos (MBS) 4. Coloque el AC en el pozo con su lado animal pigmentada abajo, en contacto con el fondo redondo del pozo. NOTA: pipetas de recubrimiento con una solución de BSA 0,1% impide la adherencia de pequeños trozos de tejido adhesivo para el plástico. </li><li> Coloque una perla en cada tapa usando una micropipeta P20. Si es necesario, el uso de fórceps para colocar cuidadosamente la perla en el centro de la tapa. NOTA: Cuando empapado en un medio acondicionado, las perlas son de color de rosa. Seleccione la mayor cantidad de coperlas lored. </li><li> Se incuba a RT (18 a 22 ° C) durante 6 horas sin mover la placa de múltiples pocillos Terasaki. El cordón se adhiere a la AC en menos de 2 hr. </li><li> Coloque la placa de múltiples pocillos Terasaki en la parte superior de papeles empapados en agua. Cubra la placa con un recipiente de plástico. NOTA: Este &#39;cámara de humedad&#39; evita la evaporación prematura de los pozos. </li><li> Cultura de la CCAA en 0.5x MBS o 3.4 NAM (véase el paso 4.1) en la cámara de humedad a 15-20 ° C hasta que los embriones hermanos han llegado a la etapa correcta para probar el efecto de su factor. </li><li> Fijar las CCAA durante 1 hora en el recién preparada PFA al 4%. Deshidratar las CCAA en 100% MeOH como se ha descrito previamente (Paso 1.4). </li></ol> 3. Animal Cap Disociación Celular y reagregación antes del injerto en un Xenopus laevis neurula <ol><li> Escudo placas de Petri (60 mm) o 12 pozos placas con 3% de agarosa en agua estéril o en PBS sin calcio y magnesio. Agregar suficiente agarosa para cubrir la bottom de la placa de Petri o el pozo. Pre-calentar las placas a temperatura ambiente (18-22 ° C). Opcionalmente, almacenado las placas durante dos días a 4 ° C para evitar la deshidratación. </li><li> Preparar libre de calcio solución salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) y solución salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6) 5. NOTA: la solución de CaCl 2 no puede esterilizarse en autoclave. </li><li> Llene la agarosa recubiertas de bien en la parte superior con solución salina libre de calcio de Holtfreter. </li><li> Prepare blástula o embriones gástrula muy tempranas para aislar sus CCAA como se describió anteriormente (pasos 2,5 a 2,7). </li><li> Aislar al menos 15 o hasta 30, pequeña CCAA 21. Usando unas pinzas finas cortan un pequeño cuadrado de tejido fuera del polo animal. El tejido AC sólo contiene células ectodérmicas y por lo tanto es de espesor uniforme. Si no es así, retire la AC del análisis. NOTA: El polo animal es la Embryparte pigmentada del o. </li><li> Transferencia de las CCAA en una agarosa recubiertas de bien lleno hasta el tope con-calcio libre de solución salina de Holtfreter. Coloque las CCAA con el frente de su lado pigmentado hacia arriba. NOTA: El proceso de disociación comienza rápidamente en libre de calcio salina de Holtfreter. </li><li> Espere unos minutos para que las células empiezan a disociar. Observar esto a través de la desagregación de los tejidos. Usando unas pinzas finas, separar la capa pigmentada desde el resto de la AC y desecharlos con una micropipeta P20. Completar el proceso de disociación celular indica separación de las células entre sí. NOTA: Uno o dos capas pigmentadas se pueden dejar en el explante re-agregado para ayudar a la visualización durante el injerto. </li><li> Centrar las células usando movimientos circulares de la placa. Usando una micropipeta P1000 retire con cuidado todo medio posible. Tenga cuidado de no tocar las células. </li><li> Añadir 1 ml de solución salina de Holtfreter con el calcio para el pozo. Transfiera las CCAA disociadasen un tubo de 1,5 ml. NOTA: 2 ml tubos no se pueden utilizar debido a su fondo redondo. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación, 5 min a una velocidad máxima de 2000 rpm para una centrífuga de mesa (500 xg). Retire con cuidado el sobrenadante con una micropipeta P1000. </li><li> Añadir a las células disociadas 20 l de solución salina de Holtfreter con calcio (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% de BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) 5. </li><li> Mantenga las CCAA disociado, de 3 a 6 horas a temperatura ambiente (18-22 ° C). NOTA: Este es tiempo necesario para que las células se re-agregado. El re-agregación es visible como las células forman una pequeña bola en la parte inferior del tubo. </li><li> Separar el explante cuidadosamente de la parte inferior del tubo mediante la adición de 1 ml de 0.5X MBS o de 1 ml de 3/4 NAM (véase el paso 4.1). Transferir el explante en una placa de un-revestido con una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Etapa los explantes utilizando sus hermanos de control. Para utilizar la cultura antibióticos a largo plazo: kanamycin (50 g / ml), ampicilina (50 mg / ml) y gentamicina (50 mg / ml). </li></ol> 4. Injerto de Animal Caps explantes en la placa neural de X. laevis Embriones <ol><li> Preparar 3 cuartos NAM (NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, EDTA 0,1 mM, 1 mM NaHCO 3, 0,2x PBS, 50 mg / ml de gentamicina). No mantener durante más de 1 semana para la disección y se almacena a 4 ° C. NAM Mayor se puede utilizar para la preparación de platos de disección de agarosa recubiertas con (abajo). </li><li> Placas de Petri Escudo (60 mm) con un 3% de agarosa en 3.4 NAM en la que los pequeños agujeros se han realizado utilizando un molde de silicona, o la tapa de una raqueta de tenis de mesa. NOTA: La agarosa cubre la parte inferior de la placa de Petri. Deje algo de espacio para que la placa de Petri se llene de 3/4 NAM. Alternativamente hacer platos de disección con la no-sequedad plastilina. Dentro de la arcilla, apretar los embriones ligeramente durante el procedimiento de disección. Dig pequeños agujeros en elagarosa utilizando pinzas redondeadas Este &#39;plato de disección&#39; ayuda a mantener los embriones durante el procedimiento de disección. </li><li> Recoger herramientas de disección: pipetas de transferencia de plástico, un &quot;cuchillo de la ceja &#39;(hecho con pelo de las cejas embebidos en parafina en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio) 22, dos pinzas de disección finas, micropipeta P1000 y consejos, un stereosmicroscope con magnificación 8-40X, una fuente de luz brillante con guías de fibra óptica. Mantenga todas las herramientas de disección limpia; después de cada experimento, enjuagarlos dos veces con agua destilada, una vez con etanol al 100% y deje secar. Almacene lejos del polvo y si autoclave necesarias las herramientas de disección metal. </li><li> Deje que la disociada y re-agregado CCAA (protocolo 3), y sus hermanos X. embriones laevis desarrollan hasta alcanzar la etapa 13 (neurula) según Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17. Para el trasplante dentro de la etapa placa neural 13 a la etapa 15 embriones se utilizan. </li><li> Llevar a cabo todasetapas subsiguientes bajo el microscopio estereoscópico. </li><li> Usando una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de los embriones en PBS con calcio y magnesio complementado con 0,2% de BSA. Retirar membrana vitelina del embrión a lo descrito previamente 20. Fijar el embrión con uno fórceps. Pellizcar la membrana vitelina con el lado de las otras pinzas. La celebración de la membrana con firmeza, lentamente despegarlo del embrión. NOTA: Realice este procedimiento en la parte ventral (vegetal) del embrión. No dañe los embriones placa neural. Si los embriones han sido dañados durante la etapa de eliminación de la membrana vitelina, la transferencia de los embriones en una placa de Petri de 60 mm que contiene 3/4 NAM utilizando una pipeta de transferencia de plástico y esperar 15 minutos, un tiempo suficiente para el proceso de curación que se produzca. </li><li> Rellene el plato de la disección a la cima con frescos 3.4 NAM. </li><li> Con una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de los embriones sin su membrana vitelina en el plato de la disección. Coloca los embriones lado dorsal arriba enlos pozos. Durante el proceso de transferencia no permita que el embrión para entrar en contacto con la interfase aire-líquido desde X. laevis se lisan por la tensión superficial. </li><li> Transferir el explante de CA para ser injertado en la placa de disección con una pipeta de transferencia de plástico o una micropipeta P1000. Una vez que la pipeta está dentro del líquido, permitir que los explantes a hundirse lentamente hacia abajo por la gravedad, o empujar con mucha suavidad. </li><li> Mantener los embriones con fórceps redondeadas. Con el cuchillo de la ceja hacer una incisión en la placa neural donde va a injertar pieza de su explante. NOTA: En la etapa 14 la curvatura anterior de la placa neural se puede utilizar como punto de referencia, que marca el territorio diencéfalo (Figura 4). </li><li> Corte un pequeño trozo de neuroepitelio, utilizando pinzas redondeadas y un knive ceja. Corte un pequeño trozo del explante con el cuchillo de la ceja. NOTA: La pieza de explante debe ser aproximadamente del mismo tamaño y forma que la zona de ablación neuroepitelio. </li&gt; <li> Coloque la pieza de explante en la incisión neuroepitelio usando el cuchillo ceja y unas pinzas finas. Asegúrese de que el explante se une rápidamente al embrión. </li><li> Alternativamente coloque un pedazo de cubreobjetos de vidrio en el embrión injertada para mantener el injerto en su lugar. Para ello, cortar un cubreobjetos de vidrio fino en pedazos muy pequeños utilizando pinzas gruesas. Asegúrese de que el tamaño es de aproximadamente 1,5 mm 2. Sumerja las piezas en una placa de Petri que contiene 3/4 NAM o PBS utilizando fórceps. Elige un pedazo de vidrio más grande que el embrión para evitar dañarlo. El embrión será un poco aplanada. </li><li> Espere al menos 30 minutos sin moverse o sólo mover la placa de disección con suavidad. Deje el embrión recuperar durante 30 min a 2 hr y retire con cuidado el cubreobjetos si es necesario. Pipetear con cuidado los embriones injertadas en un plato limpio lleno de 03.04 NAM, usando la pipeta de transferencia de plástico. NOTA: Injertado embriones tienden a desarrollar bacterias o contaminación de hongos. Para largo plazo cULTURA usar antibióticos: kanamicina (50 mg / ml), ampicilina (50 g / ml) y gentamicina (50 mg / ml). </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+neural+plate:+new+roles+for+apoptosis+and+for+one+of+its+main+effectors+caspase-3.">Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3.</a> Genesis. 53, 203-224 (2015).</li><li>Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+early+Xenopus+embryo.">Patterning the early Xenopus embryo.</a> Development. 133, 1205-1217 (2006).</li><li>Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+vertebrate+forebrain:+the+prosomeric+model.">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li><li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model.">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li><li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regionalization+of+the+diencephalon.">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li><li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Building+a+bridal+chamber:+development+of+the+thalamus.">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li><li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xotch,+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch.">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li><li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+signals,+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction.">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+old+problem,+new+findings,+yet+more+questions.">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation.">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps.">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning.">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li><li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres.">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems:+a+single+origin?.">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?.</a> Evodevo. 4, 27 (2013).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models &amp; mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy:+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells.">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth &amp; differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Desarrollo neuronal es orquestada por una compleja interacción entre los programas de desarrollo celulares y señales de los tejidos circundantes (revisado en 3,31,32). Aquí se describe un conjunto de protocolos que se puede utilizar en X. laevis embriones para explorar factores extrínsecos e intrínsecos que intervienen en la determinación del destino neural y la morfogénesis neuronal in vitro e in vivo. Estos protocolos pueden ser utilizados como tales en X. embrione...

El sistema nervioso de los vertebrados emerge de la placa neural como una capa homogénea de células neuroepiteliales. La comprensión de cómo se inducen los programas de desarrollo, codificados, y establecieron durante la regionalización de la placa neural es, en la actualidad, una meta importante en la biología del desarrollo. En comparación con otros sistemas, el embrión Xenopus experimentalmente susceptible es un modelo de elección para el análisis de los primeros pasos de 1,2 desarrollo neural. Es fácil de obtener un gran número de embriones, y el desarrollo externo da acceso a los primeros pasos de neurulation 3. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) el desarrollo embrionario. Micro-inyección de ARNm o morfolinos (MO), incluyendo OMs inducibles, junto con herramientas bioquímicas y farmacológicas, permite ganancia de función (GOF) y pérdida de función (LOF) y la alteración específica de las vías de señalización 4,5 controlada. El blastocoel techo ectodermo, situado alrededor del polo animal de una blástula, o un embrión gástrula muy temprano, y se refiere como el &quot;Cap Animal &#39;(AC), es una fuente de células pluripotentes que puede ser programado por la manipulación de la expresión génica antes de la explantes preparación. En este manuscrito son protocolos detallados para utilizar X. explantes laevis AC para poner a prueba in vitro e in vivo mecanismos moleculares y procesos celulares desarrollo neuronal subyacente. Una técnica se presenta, lo que permite la observación multa de patrones de expresión génica en un tubo neural renacuajo Xenopus, un paso preliminar en la identificación de señales de determinación de destino. Considerando que la observación de los tejidos planos montado se utiliza comúnmente en el estudio de embriones de pollo 6, no ha sido descrito adecuadamente en Xenopus. La manipulación de la expresión génica mediante la inyección de ARNm sintético o MO en los blastómeros de 2 o 4 embriones en fase celular permite la programación de ACexplantes 4. Por ejemplo inhibición de la vía proteína morfogenética ósea (BMP) por la expresión del anti-factor de BMP Noggin, da una identidad neural a las células de CA 3. El protocolo se detalla para llevar a cabo la exposición local y controlada en el tiempo de los explantes de corriente alterna a las señales extrínsecas a través de contacto directo con una perla de resina de intercambio aniónico. Finalmente se describe una técnica para el ensayo de características de desarrollo de los progenitores neurales in vivo mediante trasplante de explantes mixtos preparados a partir de células distintas programado disociados y re-asociados. El embrión de rana es un poderoso modelo para estudiar el desarrollo neuronal temprana de los vertebrados. La combinación de la manipulación de la expresión génica con la explantación cultivos in vitro proporciona información importante en el estudio de la regionalización neuroepitelio, la proliferación, y la morfogénesis 7-12. La programación de los explantes de CA permitido el desarrollo de un corazón funcional ex vivo 13,14. El usoexplante de injerto 15 condujo a la identificación del interruptor transcripcional mínimo inducir el programa de diferenciación de la cresta neural 16. La zona limitante intratalámica (ZLI) es un centro de señalización que segrega sonic hedgehog (Shh) para controlar el crecimiento y la regionalización del prosencéfalo caudal. Cuando se expone continuamente a Shh, las células neuroepiteliales coexpressing los genes del factor de tres de transcripción - BARH-como homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) y iroquois-3 (Irx3) - adquieren dos características del compartimento ZLI: la competencia para expresar shh, y la capacidad para segregar a partir de células de la placa neural anterior. Como un sistema modelo, la inducción de un destino ZLI en células neuroepiteliales será presentado 8. Estos protocolos tienen por objeto proporcionar y herramientas eficientes simples, baratas para los biólogos del desarrollo y otros investigadores para explorar el mec fundamentalhanisms de comportamientos clave de células neuronales. Estos protocolos son muy versátiles y permiten la investigación de una amplia gama de señales de determinación neuronales intrínsecos y extrínsecos. Permite a largo plazo en el análisis in vivo de compromiso de linaje neuronal, interacciones inductivas y comportamientos celulares.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;20909.290</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>anion exchange resin beads</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>For culture of animal cappH 7.6</td></tr><tr><td>Gentamycine&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&amp;nbsp;</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&amp;nbsp;for bead preparation</td></tr></tbody></table>

stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

En base a consideraciones morfológicas en diferentes especies, las manipulaciones embriológicas, y el patrón de expresión de genes reguladores, un modelo conceptual sostiene que la placa neural se divide en segmentos transversales y longitudinales que definen una rejilla de desarrollo generar campos histogenic distintas. En la placa neural, los primordios del prosencéfalo, mesencéfalo, cerebelo y la médula espinal están todos ya establecidos a lo largo del eje antero-posterior (A...

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

7.9K vistas.  Institut Curie. In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. 

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Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Neurociencias

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biología

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Generación de explantes de Blastoderm naïve a partir de embriones de pez cebra

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La neurogénesis en la evaluación primaria<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones Usando Inmunoticción

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

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