Los autores desean agradecer a James Oesterling para citometría de flujo asistencia. Esta investigación fue apoyada por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer (R01-CA178380, ZY) y una donación de US Nacional Institutos de formación postdoctoral (5T32CA009035-37, LWY).

El uso de animales en este protocolo se ha realizado de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité del Centro de Cáncer de Cuidado de Animales y el empleo Fox Chase. 1. preparación de instrumentos, soluciones y Cubreobjetos <ol><li> Limpiar dos conjuntos de # 5 pinzas finas, un conjunto de # 7 pinzas curvas finas, una tijera quirúrgica grande, uno de tijera microdissecting, una espátula y una cuchara perforada. Coloque los instrumentos en una bolsa de esterilización autosellante y autoclave. Mantenga los instrumentos en la bolsa hasta que esté listo para su uso. </li><li> Preparar una solución de agarosa de baja temperatura de fusión 3%. <ol><li> Añadir 1,5 g de agarosa en 50 ml de tampón fosfato salino estéril de Dulbecco (DPBS) y luego coloque en el microondas y el calor hasta que aparezcan burbujas. Frasco Remolino y recalentar hasta que todo agarosa ha disuelto. Mezclar la solución con una barra de agitación antes del calentamiento si aparecen grumos. </li><li> Guarde la solución en un baño a 37 ° C hasta que se necesite. </li><li> Para storag largo plazoe, almacenar la solución de agarosa para uso futuro a temperatura ambiente o a 4 ° C durante meses. Vuelva a calentar en el microondas para licuar. Para el calentamiento repetido de la solución de agarosa, se pesa el matraz antes de calentar para mantener su peso inicial con agua caliente destilada estéril. </li></ol></li><li> Preparar las siguientes soluciones para la disociación de células basados ​​en papaína como se describió previamente 2: <ol><li> Una solución de papaína con papaína (100 U / ml), cisteína (0,2 mg / ml) y DNasa (250 U / ml) en fenol rojo-estéril que contiene DPBS. </li><li> Una solución de ovomucoide con albúmina de suero bovino (BSA; 8 mg / ml), inhibidor de tripsina de soja (8 mg / ml)) y DNasa (250 U / ml) en fenol-estéril que contiene rojo DPBS. Filtro esterilizar ambas soluciones y ajustar el pH a devolver el color original del fenol que contienen rojo DPBS. </li></ol></li><li> Preparar medios de cultivo celular (NB / B27): Suplemento medios basales con piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) y suplemento B27. Filter esterilizar y protegerlo de la luz. Equilibrar los medios de comunicación a 37 ° C y 5% de CO 2 antes de su uso. </li><li> Preparar tampón FACS: suero bovino fetal al 5% (FBS) en DPBS. Añadir 2,5 ml de FBS al 47,5 ml de DPBS. </li><li> Preparar poli-D-lisina (PDL) recubiertas con cubreobjetos. <ol><li> Nuevos cubreobjetos de vidrio autoclave. </li><li> Escudo los cubreobjetos con PDL (100 ug / ml en agua destilada estéril) y se incuba durante 2 horas a 37 ° C o temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Lavado cubreobjetos con agua destilada estéril. Lavar una vez con medio NB / B27. Deje cubreobjetos se sequen por completo en el tejido campana de cultivo antes de su uso. </li></ol></li></ol> 2. disección y preparación de cortes de tejido <ol><li> En el día de la disección, limpie la zona de disección con etanol al 70% y la cubierta con una almohadilla absorbente. </li><li> Retire las herramientas de disección de la bolsa de esterilización. Añadir hielo frío, DPBS estériles / 1% P / S a una pequeña placa de Petri y el lugar en el hielo. </li><li> Decapitate P4 Math1-GFP / Nestin-PPC crías de ratón con grandes tijeras quirúrgicas a continuación, mantenga la cabeza hacia abajo con pinzas curvas finas. Quite la piel y que despegar el cráneo con # 5 pinzas finas Después vacíe el cerebro del cráneo con una espátula y lo transfieren a la placa de Petri que contiene DPBS / 1% P / S. <ol><li> Usando unas pinzas finas # 5, separar cuidadosamente el cerebelo del resto del cerebro. Asegúrese de diseccionar una cría a la vez lo más rápidamente posible. </li><li> Reunir un mínimo de 8 cerebelo con el fin de obtener suficientes NEP para los análisis moleculares y funcionales. </li></ol></li><li> Llenar un molde de inclusión de 2 x 2 x 2 cm con una solución de agarosa de baja temperatura de fusión 3%. Asegúrese de que la temperatura de agarosa es no más de 37 ° C. </li><li> Retire el exceso de líquido del cerebelo frotando suavemente sobre un pañuelo de papel de laboratorio. Coloque cerebelo en el molde en una posición vertical. Colocar el molde en hielo para permitir que se solidifique rápidamente. Utilice ~ 4 cerebella por bloque. </li><li> Obtener lisecciones de tejido ving con un vibratome cuchilla vibratoria. Recorte bloque de agarosa que contiene el cerebelo-con una hoja de afeitar. Pegar el bloque de agarosa a la placa de vibratome con orientado en una posición vertical cerebelo. </li><li> Llenar la bandeja del vibratome con heladas DPBS estériles / 1% P / S y el lugar de hielo debajo. <ol><li> Cortar 600 micras secciones a través de toda la longitud del cerebelo. Recoge las secciones de la bandeja de hielo utilizando una cuchara perforada. Se colocan los cortes en una placa de Petri llena de DPBS / 1% P / S en el hielo. </li></ol></li></ol> 3. Microdissection y disociación celular <ol><li> Coloque la placa de Petri que contiene cortes de tejido bajo un microscopio de disección fluorescente. <ol><li> Separar cuidadosamente el EGL del resto de la sección del cerebelo utilizando unas pinzas finas mediante la disección entre la PPC + capa molecular y la GFP + EGL (consulte la línea de puntos en la Figura 1). Tenga cuidado de no incluir ninguna parte de la capa molecular, que se traducirá encontaminación de Nestin-expresión de glía de Bergmann. </li><li> Completar este paso lo más rápidamente posible y mantener el tejido en hielo para evitar la muerte celular. </li><li> Retire la agarosa que rodea el tejido antes de proceder a la siguiente etapa. </li></ol></li><li> Digerir el tejido microdissected EGL utilizando un protocolo basado en papaína 2 como se describió previamente para obtener una suspensión de células individuales. <ol><li> Vuelva a suspender las células en tampón FACS para la recolección de células CFP-positivos mediante FACS. </li></ol></li></ol> 4. Cell Sorting y Plating <ol><li> Ordenar células para PPC fluorescencia utilizando un flujo de alta velocidad de citómetro estéril que contiene un filtro de PPC apropiado y recoger las células en tampón de FACS en hielo. Obtener aproximadamente 100.000 NEPs de cada cerebelo P4. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Utilice células inmediatamente para el análisis molecular o de cultivo para experimentación adicional. </li><li> Para células de cultivo, vuelva a suspender las células en pre-calentado NB / B27 media y placa en cubreobjetos recubiertos-PDL como anteriormente descritos 2. </li></ol>

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	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Riobo, N. A., Manning, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas.">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li><li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de microdisección se describe aquí es el primer procedimiento capaz de aislar una población pura de células vivas para su uso en análisis moleculares y funcionales. Como se ha demostrado por Li et al. 9, NEP obtenidos por este método pueden ser cultivadas y se incorporan en diversos experimentos y debido a su alta pureza, también se pueden utilizar para el análisis de microarrays. Es muy importante tomar el tiempo para alcanzar la competencia...

El cerebelo se compone de múltiples capas de células, cada uno con distintos tipos de células. Durante el desarrollo, el EGL contiene la proliferación de precursores neuronales de gránulos (PNB), mientras que la capa molecular y la capa de Purkinje contienen neuronas Bergmann neuroglia y de Purkinje, respectivamente. En lo profundo de cerebelo se encuentra la sustancia blanca, que contiene células madre neurales (NSC) y oligodendrocitos 1. Sonic hedgehog (Shh) juega un papel crítico en la regulación de desarrollo del cerebelo y, en particular, promueve la proliferación de PNB través de la unión a su receptor Patched (Ptc), un regulador negativo de la señalización de Shh 2-4. La activación aberrante de la señalización de Shh genera meduloblastoma (MB), el tumor cerebral maligno más común en los niños 5,6. MB mutantes modelos de ratones transgénicos de PTC son herramientas poderosas para el estudio de la MB y se desarrollan los tumores se asemejan MB humana 7,8. El uso de estosratones, se descubrió que PNB son la célula de origen de hedgehog de ​​tipo MB 7. Además, en adición a PNB, recientemente hemos identificado una población única de células progenitoras neuronales dentro de la EGL del cerebelo en desarrollo que también puede dar lugar a MB. Estas células expresan altos niveles de la proteína de filamentos intermedios VI tipo, Nestin, y se denominan NEP 9. NEP se encuentran dentro de la parte profunda de la EGL y existen transitoriamente sólo durante el desarrollo del cerebelo neonatal. Están comprometidos con el linaje de células granulares como PNB, pero son distintas, ya que son de reposo y no expresan Math1, un marcador bien establecido para la PNB convencionales 10. Además, NEP dan lugar a MB más eficientemente que PNB después de la activación de la vía de señalización Shh 9, lo que les una novela origen para MB tumorigénesis hace. Se aislaron previamente NEPs del cerebelo EGL en el día postnatal 4 (P4) mediante la técnica de microdisección9 describe aquí. Microdisección mediante visualización microscópica directa del tejido permite la disección específica de la cerebelosa EGL. Esto es necesario ya Nestin también se expresa por NSC en la sustancia blanca del cerebelo y por glía de Bergmann en la capa molecular 1,7,11,12 y era fundamental que estas células no se incluirán, como lo harían confundir el análisis. Las células aisladas de tejido microdissected se pueden utilizar inmediatamente para el análisis molecular o pueden ser cultivadas para otras aplicaciones. Para ayudar en microdissecting específicamente el EGL y para purificar aún más los NEP, los ratones Math1-GFP (proteína verde fluorescente) se cruzaron con ratones Nestin-PPC (proteína fluorescente cian). El factor de transcripción Math1 se expresa específicamente por PNB y la expresión de GFP es claramente visible en el EGL 9,13. Ratones Nestin-PPC expresan una forma nuclear de la PPC y se pueden visualizar fácilmente en la capa molecular 9,14. En conjunto, las buenas prácticas agrarias y la expresión PPC crean límites para microdisección del EGL (ver Figura 1). NEP CFP-positivas se aislaron por FACS, después de la disociación enzimática de las EGLS disecados. Actualmente, el método más bien utilizada para aislar las células de la EGL es centrifugación en gradiente de Percoll de todo el tejido cerebelar 15,16. Este método, sin embargo, no es capaz de excluir completamente las poblaciones de células nestina + de la capa molecular y la materia blanca y por lo tanto no se puede utilizar para el estudio de NEP. Microdisección de captura por láser, que utiliza la transferencia de energía de láser para eliminar las células de interés, es otro método usado para aislar las células específicas dentro de un tejido heterogéneo 17,18 pero las células capturadas sólo se pueden utilizar para la recuperación de ADN, ARN y proteínas y no son capaces de cultivarse. Este protocolo proporciona una forma de aislar específicamente una población pura vida de los PIJ de la EGL.Esta técnica también se puede aplicar a diferentes tipos de tejidos que tienen ya sea la arquitectura anatómica reconocible o células marcadas fluorescentemente / regiones. Por lo tanto, la principal ventaja de la incorporación de esta nueva técnica de microdisección en los protocolos de aislamiento de células es que las células pueden ser aisladas de regiones específicas de tejido para eliminar la contaminación de los tejidos vecinos y las células se pueden recoger inmediatamente para su análisis o se cultivaron durante otras aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure low melting temperature agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

Microdissection es una nueva técnica que puede aislar regiones específicas de un tejido y eliminar la contaminación de fuentes celulares en las zonas adyacentes. Este método fue utilizado por primera vez en el estudio de la expresión de nestina progenitoras (NEP), una población recientemente identificado de células en la capa germinal externa cerebelosa (EGL). Uso de microdisección en combinación con la clasificación de células fluorescentes activadas (FACS), una población pura de NEP se recogió por separado a partir de precursores neuronales de gránulos convencionales en la EGL y de otras células que expresan nestina contaminantes en el cerebelo. Sin microdisección, análisis funcionales de los PIJ no habría sido posible con los métodos actualmente disponibles, como la centrifugación en gradiente de Percoll y captura microdissection láser. Esta técnica también se puede aplicar para su uso con diversos tejidos que contienen cualquiera de las regiones reconocibles o células marcadas con fluorescencia. Lo más importante, una gran ventaja de este microdissectiotécnica n es que las células aisladas viven y pueden ser cultivadas para la experimentación, que en la actualidad no es posible con otros métodos descritos.

Como se muestra en la Figura 1A, rebanadas del cerebelo se prepararon a partir P4 Math1-GFP / ratones Nestin-PPC, en el que el cerebelo EGL estaba dominado por PNB que expresan GFP y la capa molecular fue enriquecida por las células gliales CFP-positivas. Para aislar los PIJ que se encuentran en la parte profunda de la EGL, rebanadas se microdissected entre el EGL y la capa molecular (por la línea discontinua; Figura 1A). EGLS diseccionado (Figura 1B)</strong...

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Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Progenitores nestina que expresan son una población recientemente identificado de progenitores neuronales en el cerebelo en desarrollo. Utilizando la técnica de microdisección se presenta aquí en combinación con la clasificación de células activadas por fluorescencia-, esta población de células puede purificarse sin contaminación de otras regiones del cerebelo y puede ser cultivado para estudios posteriores.

El aislamiento de las poblaciones celulares distinto del cerebelo en desarrollo por Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K vistas.  Temple University Health System.  Progenitores nestina que expresan son una población recientemente identificado de progenitores neuronales en el cerebelo en desarrollo. Utilizando la técnica de microdisección se presenta aquí en combinación con la clasificación de células activadas por fluorescencia-, esta población de células puede purificarse sin contaminación de otras regiones del cerebelo y puede ser cultivado para estudios posteriores. 

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

Biología

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Inmunología e Infección

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Neurociencias

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

Disección regional cerebelosa para análisis molecular

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Aislamiento y cultivo de neuronas cerebelosas primarias de ratón

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Preparation
NOTE: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Source: Edamakanti, C. R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60554">Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Aislamiento de células madre del cerebelo postnatal de ratón y diferenciación en células neurales

1. Preparation of Solutions

	Prepare tissue dissociation solution made from sterile phenol red-containing Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) ...