Este trabajo fue apoyado por fondos de RAW de las siguientes opciones: Institutos Nacionales de Salud subvenciones K01 DK083512, DP2 OD008470, y R01 DK100237; March of Dimes Basilio O&#39;Connor arranque Académico concesión de una subvención # 5 FY12-75; poner en marcha los fondos de la Universidad de Notre Dame College de Ciencia y el Departamento de Ciencias Biológicas; y un regalo generoso de la Universidad de Notre Dame de Elizabeth y Michael Gallagher, en nombre de la familia Gallagher para fomentar investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a los funcionarios del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su dedicación excepcional en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia pez cebra. Por último, agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio de investigación para sus comentarios, discusiones y puntos de vista sobre este trabajo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito los métodos que permiten la visualización de los componentes del segmento de nefronas en el pez cebra adulto. La inyección de conjugados de dextrano fluorescentes permite etiquetado PCT preferencial debido a las propiedades endocíticas de estas células del túbulo proximal 30,38. Este método se puede realizar con gran flexibilidad debido a la existencia de dextranos que se puede obtener con un grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Además, el uso de dextranos-lisina fijable es una forma especialmente conveniente para etiquetar PCT segmentos, ya que no se requieren procedimientos de etiquetado secundarias. Esto permite la detección de señal relativamente sencillo y es compatible con muchos otros marcadores fluorescentes, immunolabeling, y el uso de líneas transgénicas reportero. Etiquetado de fosfatasa alcalina también marca el túbulo proximal, con una fuerte reactividad en el PCT y reactividad ligeramente más débil en el PST. Finalmente, la tinción DBA permite el etiquetado de los segmentos tubulares distales, que muestran un characteristic ramificado morfología. Varias moléculas de lectina, que son proteínas de unión a azúcar de origen no inmune, se han utilizado ampliamente para distinguir segmentos de nefrones de mamíferos 47. Es interesante que DBA en el pez cebra se correlaciona con segmentos del túbulo distal, ya que se utiliza para marcar los conductos colectores en los riñones de mamíferos 47. Tomados en conjunto, estos métodos pueden ser utilizados en diversas combinaciones para documentar la composición y la función renal. Puesto que todos estos métodos se pueden utilizar en las preparaciones de riñón enteros, proporcionan herramientas para evaluar la estructura y la función de nefronas en todo el órgano, sin depender enteramente en el uso de más tiempo, los métodos tediosos, por ejemplo, el trabajo cryosection y immunolabeling. Sin embargo, las manchas descritas en este artículo son métodos viables en sección criogénica. Análisis criosección genera muestras (en comparación con todo el montaje) que son más adecuados para la inmunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, aunque, por supuesto, este tipo de análisis requiere la disponibilidad de anticuerpos primarios adecuados. Lamentablemente, uno de las principales limitaciones en el trabajo con el modelo animal pez cebra sigue siendo la escasa disponibilidad de anticuerpos. Así DESEO sigue siendo el más utilizado, es decir, &#39;go-to &quot;, procedimiento para el análisis de la expresión génica. DESEO utilizando reacciones de sustrato BCIP, NBT, y / o INT para producir precipitados morados o rojos no es compatible con la tinción fluorescente en cryosections. Una opción sería para invocar el uso de la detección de WISH fluorescente, un procedimiento que ha sido optimizado para muestras de embriones de pez cebra y podría ser adaptado para su uso con el riñón adulto. La descripción de los métodos en este artículo de vídeo debería permitir una mayor experimentación con técnicas como DESEOS fluorescente en combinación con las líneas de pez cebra transgénico en el que los segmentos individuales están etiquetados con un reportero como eGFP o mCherry. Alternativamente, los métodos descritos aquí COULd ser probado en combinación con otros colorantes vitales, por ejemplo, otras lectinas. De esta manera, una mayor adaptación y ampliación de los métodos descritos aquí se pueden invocar para satisfacer las necesidades del investigador para preparaciones enteras renales montaje y análisis. Como tales, estos métodos tienen un amplio potencial para la aplicación con el modelo de pez cebra para los estudios de regeneración en curso y también en el modelado de la enfermedad genética. Hay una necesidad apremiante para la investigación y los tratamientos innovadores para las aflicciones renales. Millones de personas sufren de algún tipo de enfermedad renal cada año que resulta de causas congénitas, agudos y / o crónicos. Además, la prevalencia de la enfermedad renal sigue aumentando en todo el mundo, por lo que estas enfermedades un problema de salud pública mundial 14,15. Tratamientos como la hemodiálisis están disponibles mediante el cual una máquina de diálisis externa sirve para extraer la sangre de los desechos metabólicos del paciente si sus riñones no son capaces de realizar este papel. Desafortunadamente, Esta intervención tiene limitaciones, como el tratamiento continuo es necesario para la supervivencia. Por otra parte, los pacientes necesitaran un trasplante de riñón, que puede tomar años para recibir una vez que un paciente se coloca en una lista de espera. Incluso después de la obtención de un trasplante de riñón, muchos pacientes sufren efectos adversos como resultado del procedimiento y deben luchar contra estos efectos para el resto de sus vidas. Estas dificultades ponen de manifiesto la necesidad seria para el desarrollo de nuevos tratamientos para ayudar a prevenir ya sea enfermedad del riñón o tal vez para aumentar la regeneración de tejidos 8,16,52,53. Dadas las limitaciones éticas evidentes del uso de sujetos de prueba humanos en laboratorios biomédicos, los modelos animales son esenciales para el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana y para la prueba de nuevos tratamientos. Como resultado de su similitud y proximidad anatómica evolutiva, el ratón se ha convertido en el modelo más ampliamente utilizado de la enfermedad humana 45. Sin embargo, hay ciertas limitaciones con este animal, incluído,ing incapacidad para visualizar el desarrollo de órganos in vivo y la practicidad de completar pantallas genéticos a gran escala. El pez cebra es un organismo relevante y útil modelo para el estudio del desarrollo de órganos y el modelado de la enfermedad humana 45,46. En lo que respecta a las enfermedades humanas, existen homólogos funcionales en el pez cebra para casi el 70% de todos los genes humanos 54,55. Trabajos recientes han puesto de manifiesto la utilidad de pez cebra para muchas áreas de la investigación renal 31,37,56. Los estudios de regeneración y reparación en el pez cebra después de AKI sugieren que la regeneración del epitelio del túbulo y neonephrogenesis son dos procesos que se producen y se superponen a lo largo de la regeneración timecourse 30,37. El uso de un llamado gentamicina antibiótico aminoglucósido se ha utilizado como un paradigma de lesión a través del cual para estudiar los resultados de AKI en 29,30,37 adultos de pez cebra. Durante un período de dos semanas después de una lesión de aproximadamente de gentamicina, el Tubul proximales regeneran, y mientras tanto nuevas nefronas se forman a lo largo del órgano 29,30,37. En general, los mecanismos que regulan la regeneración epitelial siguen siendo muy controvertidos. En un mecanismo propuesto del proceso de reparación, no es el evento inicial de lesión aguda seguida de un desprendimiento de las células muertas en el lumen. A continuación, hay una serie de de-diferenciación, proliferación, y eventos de migración, después de lo cual las nuevas células se diferencian, repoblación de la membrana basal heridos y restaurar la función a la zona lesionada. Por otra parte, otros estudios han sugerido que las células de reemplazo se derivan de células madre / progenitoras que residen dentro de los túbulos nefrona. En cuanto al proceso de neonephrogenesis en el pez cebra, los agregados celulares se han observado siguiente AKI por inyección de gentamicina 29,30. Estos agregados posteriormente maduran hasta convertirse en nuevas nefronas que sondean en los túbulos ya existentes 29,30. El hilo común que une nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis es su factor de misterio enorme: en la actualidad no son exponencialmente más preguntas acerca de cómo se producen estas hazañas regenerativas que existen puntos de vista disponibles. Hasta la fecha, sin embargo, varias líneas interesantes de evidencia apoyan la noción de que la investigación de regeneración renal utilizando el pez cebra puede de hecho brindar conocimientos comparativos pertinentes en AKI humano que también puede tener directa traslacional potencial 56-58. Química de detección para identificar pequeñas moléculas que aumentan la proliferación de células progenitoras renales en el embrión de pez cebra recientemente llevado a la identificación de la -butanoato inhibidor de histona desacetilasa metil-4-(feniltio) (m4PTB) 56,57. La administración de este compuesto para las larvas de pez cebra con inducida por gentamicina-AKI reveló que la supervivencia larval aumenta y que la proliferación tubular renal se mejoró 56,58. Cuando los ratones con lesión renal aguda inducida por isquemia moderada fueron tratados con m4PTB, su recuperación se aceleró en asociation con una reducción tanto en la atrofia y el ciclo celular tubular detención de la proliferación de las células tubulares renales 58. Estos hallazgos sugieren que las vías responsables para el desarrollo normal del pez cebra renal y / o la respuesta regenerativa a AKI se conservarán con los mamíferos 56. Así, mientras que se necesitan más estudios para desmenuzar los mecanismos de regeneración-es decir, para identificar las vías de señalización que intervienen y comprender su interacción-el pez cebra proporciona una vía prometedora para perseguir esta meta importante en el campo de la nefrología. Herramientas tales como las etiquetas de células nefrona descritos en este protocolo representan un grupo de ensayos que pueden ser utilizados para evaluar la composición y la funcionalidad renal en modelos AKI. Además, se pueden aplicar para caracterizar modelos transgénicos de la enfermedad renal y pueden proporcionar maneras de identificar agentes terapéuticos químicos capaces de promover la restauración de la estructura después de la presa nefrona renalla edad.

El riñón es un órgano complejo que cumple con una multitud de funciones fisiológicas en el cuerpo. La función principal del riñón es la excreción de desechos metabólicos, y esta tarea está estrechamente entrelazada con el mantenimiento de la homeostasis de fluidos. El riñón realiza estos trabajos mediante el filtrado de la sangre y la formación de la orina, mientras que concomitantemente regulación de la presión arterial, los niveles de electrolitos y el equilibrio ácido-base. Túbulos epiteliales altamente especializadas, llamadas nefronas sirven como unidad funcional básica del riñón 1,2. En los vertebrados adultos, nefronas se organizan típicamente en una disposición en espiral que rodea herméticamente un sistema de drenaje centralizada, permitiendo así que para muchos túbulos tapen la bastante pequeño órgano. Por ejemplo, cada riñón humano puede contener más de 1 millón de nefronas 3. Otros mamíferos como el ratón son en el orden de 8 a 10.000 nefronas por riñón 4. El grado de complejidad renal difiere entre estos mamíferos y otros vertbrados debido a las variaciones en el número total de nefronas y su diseño arquitectónico dentro del riñón. Especies de vertebrados forman hasta tres estructuras renales sucesivas durante el desarrollo, y cada formulario muestra el aumento de la complejidad en lo que respecta a la dotación de nefronas y disposición: los pronefros, mesonefros y metanefros. La última estructura renal que deben conservarse sirve como el riñón adulto órgano-típicamente un mesonefros o un metanefros 2. Cada forma de riñón, sin embargo, tiene una composición basada en nefrona 2. La nefrona es el caballo de batalla de los riñones y es responsable de la filtración de la sangre junto con la secreción y reabsorción de metabolitos. Las nefronas son estructuras tubulares simples compuestas de células epiteliales y tienen una organización segmentaria, en el que los dominios discretos, altamente especializadas de los epitelios diferenciados realizar tareas específicas. En el orden del flujo de filtrado a través de las nefronas, normalmente hay tres partes principales que comprise cada unidad: (1) el corpúsculo renal, (2) un túbulo con proximal, intermedio y segmentos distales, y (3) un conducto colector 1. El túbulo proximal es responsable de la reabsorción de solutos orgánicos, principalmente glucosa y los aminoácidos 1. El túbulo intermedio (o asa de Henle) es un importante sitio de la sal y el agua la regla 1. Finalmente, ajuste fino de la sal y otros iones produce en el túbulo distal y el conducto colector y está muy regulada por el sistema endocrino 1. A partir de ahí, el filtrado viaja a través del uréter y de la vejiga, en última instancia, saliendo el cuerpo como un producto de desecho 1. La pérdida de la función renal puede deberse a multitud de causas que impiden la actividad normal de nefronas. Estas causas pueden ocurrir durante el desarrollo del riñón, por ejemplo, defectos congénitos que llevan a la malformación de nefronas 5 o causas de los diferentes tipos de lesiones (derivada de tanto genéticos como environmeorígenes NTAL). Lesiones adquiridas son una categoría como la lesión renal aguda (IRA) o insuficiencia renal crónica (ERC). AKI implica una pérdida abrupta de la función renal, a menudo como resultado de la isquemia o la toxina de exposición 6,7. En los mamíferos, la reparación del epitelio nefrona es posible después de este tipo de lesiones 8, y muchas personas presentan la restauración completa de la función renal después de AKI. Sin embargo, AKI también se asocia con una alta morbilidad y mortalidad que se han reportado en un amplio 30 - rango de incidencia del 70% 6,7. ERC, en cambio, está asociada con la pérdida progresiva de la función renal que resulta de años de daño prolongado, típicamente asociado con la fibrosis 8,9. Además, existe una interacción entre la IRA y ERC, como cualquiera puede predisponer a un individuo a otro 10-12. Por ejemplo, aquellos que han sufrido de AKI son más susceptibles a la enfermedad renal crónica e incluso la muerte 13. La incidencia de la enfermedad renal, tanto en los EE.UU. y en todo el mundo, ha alcanzado epideproporciones de micrófono y se prevé que aumentará a medida que la población de edad se amplía-por lo tanto hay una necesidad creciente de identificar intervenciones de medicina regenerativa para el riñón 14,15. A pesar del conocimiento de que los pacientes con LRA pueden recuperar, por mucho tiempo se ha pensado que el riñón es un órgano sin poderes regenerativos innatas. Esta visión tradicional ha sido revisado de manera espectacular en los últimos años 16. Los estudios que investigan el daño renal en ratones y ratas después de la IRA han demostrado que las células epiteliales de los túbulos nefrona pueden proliferar y reconstruir nefronas funcionales 17-20. Aunque los mamíferos poseen esta capacidad de adaptación para regenerar nefronas, existen limitaciones notables y las respuestas de mala adaptación puede ser desencadenados que conducen a la fibrosis renal y ERC 21. Por ejemplo, un estudio reciente demostró que la ablación repetida de células epiteliales en nefronas murinos se asoció con la regeneración disminuida y fibrosis nefronas renales HAV-sugiriendoea limita umbral de regeneración 22. No hay evidencia de que el riñón de mamíferos adultos forma nuevas nefronas para reemplazar los perdidos o dañados, por lo tanto su destrucción conduce a un déficit de 8,9 nefrona permanente. Curiosamente, algunos vertebrados responden a AKI por la regeneración de los epitelios de nefronas y también la producción de nuevas nefronas, un proceso conocido como neonephrogenesis o nefrona neogénesis 23. Neonephrogenesis ocurre en los peces después de la exposición a tóxicos o resección parcial y modelos de lesión históricamente han incluido los peces de colores 24,25, tilapia 26, patín 27, medaka 28, y más recientemente, el pez cebra 29,30. De éstos, el pez cebra proporcionar un modelo de investigación genética viable para descubrir las vías celulares y moleculares responsables de la regeneración renal. En este artículo de vídeo, nos demuestran cómo etiquetar los segmentos de la nefrona en el pez cebra adulto. El conocimiento de la anatomía de nefronas, las características moleculares,y las características funcionales son esenciales para los estudios renales futuros exitosos utilizando el pez cebra. El riñón adultos de pez cebra es una estructura mesonefros y es inherentemente menos complejo en cuanto a número de nefronas y organización de la estructura metanefros se encuentra en los mamíferos adultos, aves y reptiles 31. Sin embargo, la organización del segmento de nefronas pez cebra es análogo a los mamíferos, y se documentó por primera vez en el riñón de embriones en base a estudios de expresión génica 31-35. Nefronas embrión de pez cebra contienen segmentos lineales tubulares que incluyen el túbulo contorneado proximal (PCT), túbulo proximal recto (PST), distal temprana (DE), y distal tardía (DL) 31-35 (Figura 1). Nefronas adultos de pez cebra poseen segmentos tubulares similares 30,31,36,37 (Figura 1). El PCT también se puede identificar por un fenotipo funcional: las células epiteliales en la PCT incorporarán compuestos de dextrano marcados con fluorescencia (10-70 kDa en tamaño) presentes en elcirculación, que se ha utilizado tanto en el pez cebra riñón embrionarias y adultas para evaluar la captación endocítica por estas células del túbulo proximal 38-41 (Figura 1). Una de las diferencias en los segmentos de la nefrona entre el pez cebra y mamíferos es que el pez cebra carecen de un túbulo intermedio o asa de Henle 30-37; ya que este segmento funciones en los mamíferos para conservar el agua, y el pez cebra son una especie de agua dulce, sin la urgencia de concentrar la orina, no es de extrañar que el pez cebra carecen de este segmento de 32,33. Así, la composición global nefrona se conserva en gran medida entre el pez cebra y el riñón de los mamíferos 32,33. Estas similitudes han permitido pez cebra a ser una herramienta de investigación eficaz para investigar las funciones de los genes renales-expresado durante nefrogénesis desarrollo 32-35,42 y modelar numerosas enfermedades renales 43,44, lo que añade a la lista sustancial de las condiciones humanas que pueden ser investigado utilizandopez cebra 45,46. Hoy en día, el riñón adultos de pez cebra es un modelo atractivo para los estudios comparativos de la regeneración renal debido a su maleabilidad genética y el paladar expansión de los recursos tecnológicos disponibles para interrogar a la función de genes y vías de señalización en esta especie. Varios estudios han utilizado el mesonefros pez cebra para investigar los mecanismos de regeneración después de AKI 29,30,37. Para continuar la investigación AKI usando el riñón adultos de pez cebra, es esencial disponer de métodos exquisitos para etiquetar las diferentes regiones y métodos nefrona para estudiar la funcionalidad de nefronas. Existen varios métodos para el análisis de riñón adulto han sido adaptados de los protocolos de riñón embrionario. La inyección intraperitoneal de dextrano marcado con fluorescencia en el pez cebra adultos etiqueta el epitelio PCT en mesonefros nefronas a través de endocitosis 30, como en embriones de pez cebra 38-41 (Figura 1). Este método ha sido utilizado para visualize cuando los túbulos proximales a recuperar su propiedad reabsorbiendo siguiente AKI, que permite una evaluación de la función fisiológica restaurado 30 (Figura 1). Otra característica de la nefrona túbulo proximal es que las células epiteliales en este segmento poseen un borde en cepillo 37 que muestra altos niveles de actividad de la fosfatasa alcalina endógena. Por lo tanto, el epitelio proximal puede ser localizada visualmente en el riñón pez cebra adultos usando una técnica basada en la fluorescencia conocido como elfo (marcado con enzima-Fluorescencia) -97 47. Aquí se describe cómo llevar a cabo ensayos de absorción de dextrano fluorescentes 30,48 en el riñón adultos de pez cebra, a fin de obtener una evaluación funcional del túbulo proximal y mapear el tamaño y los contornos de este segmento tubular. A continuación, se describen las técnicas para etiquetar las regiones del túbulo proximal de la nefrona adulto con la etiqueta fluorescente fosfatasa alcalina. En tercer lugar, se muestra por primera vez que el rodioamina marcada con lectina aglutinina Dolichos biflorus (DBA), que se ha utilizado como un marcador general de los conductos colectores en el riñón de los mamíferos 49, marca los túbulos distales del riñón adultos de pez cebra. Como DBA es mutuamente exclusivo a la tinción de fosfatasa alcalina, estas etiquetas proporcionan una manera de distinguir ampliamente pan-proximal frente tramos pan-distales de la nefrona adultos de pez cebra. A lo largo de la ejecución de estas manchas fluorescentes en toda ambas montura y secciones histológicas de criostato, relacionamos estas etiquetas con dominios de expresión de genes transportadores de soluto que identifican de forma única cada segmento de la nefrona. Por lo tanto, este protocolo también contiene una guía de los procedimientos de procesamiento de tejidos modificados para tejido adulto todo el montaje hibridación in situ (DESEO) el análisis basado en el protocolo DESEO embrión 50. Estos procedimientos se pueden utilizar en diversas combinaciones (Figura 2) para documentar atributos morfológicos y funcionales of adultos nefronas renales pez cebra. Por lo tanto, estos protocolos se pueden aplicar a estudios de regeneración, la caracterización fenotípica de otros modelos de enfermedades renales, e incluso utilizarse para estudiar la formación del riñón adulto.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Made by diluting 10 X PBS in distilled water.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS with 0.05 % Tween</td><td></td><td></td><td>0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&amp;deg;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Other modeling clays can be substituted and work similarly</td></tr><tr><td>Slide holder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Optional: cardboard tray to store slides flat</td></tr><tr><td>Bleaching solution</td><td></td><td></td><td>Bleach mix formula (for a 20 ml solution):&lt;br/&gt; 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution&lt;br/&gt; 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution&lt;br/&gt; 100 &amp;mu;l of 20% Tween&lt;br/&gt; Fill to 20 ml with distilled water</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Solution (for a 10 ml solution):&lt;br/&gt; 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween&lt;br/&gt; 2 ml of fetal calf serum&lt;br/&gt; 150 &amp;mu;l of DMSO</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase activity detection</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&amp;nbsp; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#039;s instructions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase wash solution</td><td></td><td></td><td>Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):&lt;br/&gt; 5 ml of 0.5 M EDTA&lt;br/&gt; 120 mg of Levamisole&lt;br/&gt; 95 ml of 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Staining Solution (for a 100 &amp;mu;l solution):&lt;br/&gt; 1 &amp;mu;l of DBA&lt;br/&gt; 99 &amp;mu;l of 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 adhesive microscope slides</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker &amp;ndash; super PAP pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&amp;trade; HM 525 Cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

El modelo de pez cebra se ha convertido en un sistema relevante para estudiar el desarrollo del riñón, la regeneración y la enfermedad. Tanto los riñones de pez cebra embrionarias y adultas se componen de unidades funcionales conocidas como nefronas, que son altamente conservadas con otros vertebrados, incluyendo mamíferos. Investigación en el pez cebra se ha demostrado recientemente que los dos fenómenos distintivos transpiran después de nefronas adultos incurren en daños: en primer lugar, hay una regeneración robusta dentro de las nefronas existentes que reemplaza las células epiteliales del túbulo destruidas; segundo, totalmente nuevas nefronas se producen a partir de progenitores renales en un proceso conocido como neonephrogenesis. En contraste, los seres humanos y otros mamíferos parecen tener sólo una capacidad limitada para la regeneración epitelial nefrona. Hasta la fecha, los mecanismos responsables de estos fenómenos de regeneración renal siguen siendo poco conocidos. Desde riñones pez cebra adultos sufren tanto nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis, proporcionan un párrafo experimental excepcionalparadigma para estudiar estos eventos. Además, existe una amplia gama de herramientas genéticas y farmacológicas disponibles en el modelo de pez cebra que se pueden utilizar para delinear los mecanismos celulares y moleculares que regulan la regeneración renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe un conjunto de técnicas de etiquetado que se pueden utilizar para medir la composición y la funcionalidad renal nefrona prueba en el riñón adultos de pez cebra. Por lo tanto, estos métodos son ampliamente aplicables para el futuro caracterización fenotípica de los paradigmas de pez cebra adultos lesión renal, que incluyen pero no se limitan a, los regímenes de exposición nephrotoxicant o métodos genéticos de la muerte celular específica, tales como la técnica de ablación celular mediada por nitrorreductasa. Además, estos métodos pueden ser utilizados para estudiar la formación de perturbaciones genéticas en riñón adulto y también podrían aplicarse para evaluar el estado renal durante el modelado de la enfermedad crónica.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

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Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Biología

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

In situ Hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modelo de lesión renal aguda inducida por cisplatino en pez cebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicina

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Depigmentation and Prestaining of Zebrafish Kidney: A Technique to Prepare Adult Zebrafish Kidney for Staining

Source: McCampbell, K. K. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/51644" target="_blank">Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2014)
In this video, we demonstrate the depigmentation of adult zebrafish kidney and its subsequent preparation for staining procedures. Post-staining, the adult zebrafish kidney can be used for studying kidney regeneration, phenotypic characterization of renal disease models, and nephron functionality.