El proyecto que se describe fue apoyado por el premio número R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) del Instituto Nacional de Salud Mental. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud Mental o el Instituto Nacional de Salud.

El siguiente protocolo describe el procedimiento estándar para aislar el ARN de CSF y de perfil microRNAs utilizando placas PCR listos. Tenga en cuenta que la extracción en fase orgánica es opcional, y que un ARN transportador se añade a la muestra durante la extracción asegurar la recuperación máxima de ARN. En consecuencia, no hay necesidad de cuantificar el ARN. En general, un promedio de 6-8 placas se puede ejecutar en un día si el ADNc se sintetiza el día antes (aproximadamente 2 horas). Análisis de los datos se realiza cuando todas las muestras se han perfilado y se cargan en el software. Dependiendo del número de muestras / grupos o su combinación para la comparación, el análisis de datos puede requerir de una a varias horas. 1. La extracción de RNA La extracción de ARN se realizó a partir de muestras de LCR, se almacenaron congeladas a -80 ° C en alícuotas hasta su análisis. Para este procedimiento se utilizó el kit de aislamiento mirVana París, siguiendo instrumento del fabricantecciones para el aislamiento de ARN total. Tenga en cuenta que, a pesar de enriquecimiento para las pequeñas especies de ARN es posible con este equipo, este paso no se hace y el procedimiento de extracción de ARN se terminó después de la etapa de aislamiento total de ARN. Además, aunque el kit de aislamiento de mirVana París (al igual que otros kits de aislamiento de ARN disponible comercialmente) no requiere la extracción de orgánicos, un protocolo para este procedimiento se puede encontrar a continuación. El protocolo para la extracción de ARN consta de dos pasos: 1.1. Extracción Orgánica (no es necesario si se utiliza el kit de extracción de RNA mirVana Paris) 1.2.2. Aislamiento de ARN total 1.1. Extracción orgánica 1.1.1. Preparar reactivos <ol><li> Añadir 375 l de 2-mercaptoetanol a 2x solución desnaturalizante, y almacenarlo a 4 ° C. </li></ol> 1.1.2. Prepare el CSF <ol><li> Descongele cada alícuota de CSF en hielo antes de la extracción de RNA. Añadir 1 g de ARN portador MS2 a 0,5 ml de LCR descongelado y suavementemezclar. Tenga en cuenta que si la extracción orgánica se omite, se añadirá el portador MS2 a la muestra de aislamiento de ARN antes descrito en 1.2.2.1 a continuación. </li><li> Mezclar 0,5 ml de 2x solución desnaturalizante a temperatura ambiente a la LCR. </li><li> Añadir 1 ml de ácido-fenol: cloroformo a la CSF más la solución desnaturalizante 2x: asegúrese de retirado la fase inferior que contiene ácido-fenol: cloroformo, no el tampón acuoso que se encuentra en la parte superior de la mezcla. Además, tenga en cuenta que el ácido fenol: cloroformo contiene fenol, que es un veneno y un irritante, use guantes y otros equipos de protección personal cuando se trabaja con este reactivo. </li><li> Vortex durante 30-60 segundos para mezclar. Por conveniencia, los 2 ml de muestra / solución desnaturalizante / ácido-fenol: cloroformo mezcla se dividen en dos tubos Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 min a velocidad máxima (10.000 x g) a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidado la fase acuosa (superior) sin perturbar la fase inferior o la interfase y transferirlo a untubo fresco. Tenga en cuenta el volumen recuperado. </li></ol> 1.2. Aislamiento de ARN Se recomienda contar con un banco dedicado, juego de pipetas y bastidores para el manejo de muestras de ARN. La zona de trabajo y herramientas se descontaminan utilizando aerosol RNasa Zap y toallitas antes de cada experimento. 1.2.1. Preparar reactivos: <ol><li> Añadir 21 ml de etanol al 100% a los genes miARN Solución de lavado 1 y 40 ml de etanol 100% a la solución de lavado 2/3. Tenga en cuenta que miRNA Wash Solution 1 contiene tiocianato de guanidina que es una sustancia potencialmente peligrosa. </li></ol> 1.2.2. Aislamiento de ARN total <ol><li> Añadir 1,25 volúmenes de temperatura ambiente 100% de etanol a la fase acuosa de la extracción orgánica y mezclar bien. </li><li> Coloque un cartucho de filtro en uno de los tubos de recogida. </li><li> Pipeta no más de 700 l de la mezcla de lisado / etanol en el cartucho del filtro. </li><li> Centrifugar durante 30 segundos a máximavelocidad. Aplique la mezcla superior a 700 l en aplicaciones sucesivas con el mismo filtro. Deseche el flujo continuo después de cada centrifugación y guardar el tubo de recogida para los pasos de lavado. </li><li> Aplicar 700 l miRNA Wash Solution 1 para el cartucho del filtro y centrifugar durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. </li><li> Aplicar 500 l Solución de lavado 2/3 y se centrifuga durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Aplique una segunda 500 l Solución de lavado 2/3 y se centrifuga durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche el flujo a través del tubo de la colección y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección. Girar el conjunto durante 1 min a velocidad máxima para eliminar el líquido residual desde el filtro. </li><li> Transferir el cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco. Aplicar 100 y mu; L de precalentado (a 95 ° C) de nucleasa libre de agua para el centro del filtro, y cerrar la tapa. Centrifugar durante 30 segundos a la velocidad máxima para recuperar el ARN. </li><li> Recoger el eluido que contiene ARN y almacenarlo a -80 ° C para aplicaciones posteriores. </li><li> Cuantificar 1 l de ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000c. Tenga en cuenta que la cuantificación del ARN se puede omitir si un portador de ARN se añade a la muestra durante la extracción de RNA. En ese caso 8 l de ARN se sometió a síntesis de ADNc como se detalla a continuación. </li></ol> 2. miRNA Perfil: Protocolo QRT-PCR El protocolo para miARN perfiles consta de dos pasos: <ol><li> Síntesis de ADNc de primera cadena </li><li> La amplificación por PCR en tiempo real </li></ol> 2.1. Síntesis de ADNc de primera cadena 2.1.1. Diluir ARN molde <ol><li> Ajustar cada una de las muestras de ARN plantilla a una concentración de 5 ng / l utilizando nucleasa libre de agua. Si elARN no ha sido cuantificada (véase el paso 1.2.2.9), a continuación, 8 l de ARN se utilizan para la síntesis de ADNc </li></ol> 2.1.2. Preparar reactivos <ol><li> Descongelar suavemente el tampón de reacción 5x y nucleasa libre de agua, y colocar inmediatamente en hielo. </li><li> Mezclar por agitación. Resuspender la espiga-en añadiendo 40 l de nucleasa libre de agua al tubo y mezclar mediante agitación ARN; dejarlo en hielo durante 15 a 20 min. Inmediatamente antes de su uso, retire la mezcla de enzimas del congelador, se mezcla con un movimiento rápido de los tubos y colocar en hielo. Centrifugar todos los reactivos. </li></ol> 2.1.3. Configuración reacción de transcripción inversa <ol><li> Preparar la cantidad requerida de solución de trabajo de RT en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, o equivalente (en las proporciones indicadas en la Tabla 1, a excepción de la plantilla de ARN), mezclar mediante agitación (1-2 segundos a velocidad máxima), girar brevemente abajo ( utilizamos un mini centrífuga Eppendorf con velocidad fija, 10 seg) y colocarlo en hielo. Tenga en cuenta que la espiga ARN UniSp6-En se añade a la muestra antes de la reacción de RT (ver Tabla 1). </li><li> Vierta la solución de trabajo RT en tubos para PCR libre de nucleasa. </li><li> Dispensar plantilla de ARN en cada tubo. Nota: recuerde que debe calcular 10% de exceso de volumen / cada reactivo para pipetear y / o volumen muerto robótica. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Panel I Volumen (l) </td><td> Panel I + II Volumen (l) </td></tr><tr><td> Tampón de reacción 5x </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Libre de nucleasa agua </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> Mezcla de enzimas </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 ARN Punto-en la plantilla </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> ARN total plantilla (5 ng / l) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Volumen Total </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Invierta configuración reacción de transcripción. </li></ol> 2.1.4. Mezclar y centrifugar reactivos <ol><li> Mezclar la reacción por suave (1-2 segundos) vórtex para asegurar que todos los reactivos se mezclan a fondo. Después de mezclar, centrifugar (mini centrífuga Eppendorf con velocidad fija, 10 seg). </li></ol> 2.1.5. Incubar e inactivar el calor <ol><li> Programar una máquina de PCR de la siguiente manera: </li><li> Incubar durante 60 min a 42 ° C </li><li> Calor-inactivar la transcriptasa inversa durante 5 min a 95 ° C </li><li> Enfríe inmediatamente a 4 ° C </li><li> Almacenar a 4 ° C o congelación Nota: el protocolo se puede interrumpir en esta etapa. El cDNA diluido se conserva a -20 ° C durante un máximo de 5 semanas (tiendas opcional a 4 ° C durante un máximo de 4 días). </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. La amplificación por PCR en tiempo real 2.2.1. Preparar los reactivos para la PCR en tiempo real <ol><li> Coloque cDNA (del paso 2.1.5) en hielo. </li><li> Agua libre y Master PCR mix nucleasa Descongelar en hielo. Proteja los viales mezcla maestra de PCR de la luz cubriéndolos con papel de aluminio. Inmediatamente antes de su uso, mezclar la mezcla maestra de PCR por agitación 1-2 seg en una mini centrífuga y centrifugar a 1500 xg durante 1 min. </li></ol> 2.2.2. Combine la mezcla SYBR verde master, agua y cDNA y agregar a las placas PCR Se recomienda el siguiente procedimiento para evitar bajas concentraciones de cDNA se adhiera a la superficie del tubo: <ol><li> Antes de retirar la junta de la placa, girar brevemente abajo de la placa (s) en una centrífuga refrigerada a 1500 xg durante 1 min. </li><li> En un tubo cónico de 15 ml, combinar 2x PCR Master Mix y agua. Panel I: 2.000 l 2x mezcla maestra y 1.980 l de agua; Panel I + II: 4.000 l 2x mezcla maestra y 3960 μ; L de agua. </li><li> Añadir 20 l cDNA (panel I) o 40 l cDNA (panel I + II) y mezclar. </li><li> Mezclar suavemente por agitación 1-2 segundos y girar en una centrífuga refrigerada a 1500 xg durante 1 min. </li><li> Coloque la PCR Master Mix / cDNA mezcla en un depósito pipeta multicanal. Puede que tenga que identificar a un depósito que tiene la longitud de la pipeta multicanal. Esto mantiene el nivel de volumen lo suficientemente alto como para permitir alícuotas iguales de volumen en todo el multicanal. Esto es crítico hacia los últimos alícuotas. </li><li> Dispensar 10 l Master mezcla PCR / cDNA mezcla a cada pocillo de la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta de 16 canales. </li><li> Sellar la placa con sellado óptico. </li><li> Girar la placa brevemente en una centrífuga refrigerada (1500 xg durante 1 min), para mezclar las soluciones y eliminar las burbujas de aire. Nota: el experimento se puede detener en este punto. Guarde las reacciones protegidos de la luz a 4 ° C durante un máximo de 24 horas. </li></ol> 2.2.3. Real-Time PCR Realizar la amplificación por PCR en tiempo real y análisis de curva de fusión después de los parámetros que se detallan en la Tabla 2. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Paso del proceso </td><td> Configuración, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polimerasa de activación / Desnaturalización </td><td> 95 ° C, 10 min </td></tr><tr><td> Amplificación </td><td> 45 ciclos de amplificación en 95 ° C, 10 seg 60 ° C, 1 min -Tasa de rampa 1,6 ° C / seg Lectura óptica </td></tr><tr><td> Análisis de la curva de fusión </td><td> Sí </td></tr></tbody></table> Tabla 2. En tiempo real las condiciones del ciclo de PCR utilizando el Roche LightCycler 480. 2.3. Análisis en tiempo real de datos de PCR En tiempo real el análisis de datos de PCR se realiza con la Exiqon de GenEx profesional 5.0, siguiente trecomendó instrucciones. El manual de GenEx paso a paso se puede descargar en <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> El análisis de datos se compone de tres pasos: <ol><li> Importación de datos </li><li> Preprocesamiento de los datos </li><li> El análisis estadístico </li></ol> 2.3.1. Importación de datos <ol><li> En la Roche LightCycler 480 seleccionar el método de análisis nd derivado 2 y calcular los valores Cq. Los datos se exportan en forma de tabla y se guardan como archivos de texto. </li><li> Para importar los datos, abierta de GenEx y haga clic en el botón Asistente de importación Exiqon y haga clic en &quot;Inicio&quot;. Siga las instrucciones para seleccionar el formato, el instrumento y archivo de diseño de placa (s). Tenga en cuenta que los archivos de diseño de placa (excel) son descargados desde el sitio web Exiqon ( <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Import Paneles I y II, y haga clic en &quot;Siguiente&quot;. </li><li> La tabla generada después de archivo de importación contiene columnas predefinidas. Nombres de muestras se pueden editar y columnas de clasificación se pueden agregar o quitar en este paso. Haga clic en &quot;Siguiente&quot; cuando haya terminado. </li><li> Guarde los datos y cargar a Editor de datos. </li></ol> 2.3.2. Preprocesamiento de los datos <ol><li> Según lo recomendado por Exiqon y de GenEx, al comparar múltiples placas lo primero que debe hacer es calibrar los datos entre las placas por la elección de calibración entre plato en el menú pre-procesamiento. </li><li> Se recomienda ejecutar arrays miARN en carreras por triplicado. Si un miARN no está presente en al menos dos de cada tres réplicas que se establecerá como nonexpressed. </li><li> En el siguiente paso en el procesamiento previo, establecer un punto de corte. Definición de un valor de corte indica que los datos con un ciclo umbral (C t) superior a este valor se descartan. En los presentes experimentos utilizando muestras de líquido cefalorraquídeo, el valor de corte se fijó en 39. Therntes, se descartarán todas las muestras con una C t por encima de 39 en las tres réplicas. Si un miARN tiene una T C&gt; 39 para una sonda (una réplica de tres), que la lectura será reemplazado con el promedio de la C t para los otros dos sondas, siempre que sean tanto por debajo de 39. </li><li> Definir los genes de referencia. De GenEx Professional tiene la opción de utilizar geNorm y / o NormFinder para identificar genes de referencia. Seleccione una lista de miRNAs que tienen valores similares en todos Cq muestra y se ejecutan geNorm y / o NormFinder. De acuerdo con este análisis, en el ejemplo dado aquí, miR-622 y miR-1266 tuvieron los valores más uniformes a través de las muestras y fueron elegidos como los genes de referencia (Figura 1). </li><li> A continuación, los datos se normalizaron utilizando los genes de referencia y los valores obtenidos se corresponden con el t? C </li><li> Si se realizaron reacciones de síntesis de ADNc por triplicado, en este momento los valores deben promediarse. </li><li> Validar la hoja para volvermover las columnas vacías y casi vacías. En la ventana de procesamiento previo, seleccione &quot;Validar hoja&quot; y que se aplican en la línea de las columnas vacías Remove. En la línea de abajo, elegir el porcentaje deseado de datos válidos y haga clic en Aplicar. Por ejemplo, seleccione 100% si desea comparar sólo miRNAs comunes a todas las muestras. </li><li> Manipular los datos que faltan. Seleccione &quot;Datos que faltan&quot; en el menú de preprocesamiento y eligió una de las opciones para manejar los datos faltantes. Este paso es necesario. Tenga en cuenta que de GenEx te dará error si intenta cargar archivos que contengan datos que faltan no controladas. </li><li> Determinar la cuantificación relativa entre los grupos de muestras (es decir. Experimento frente al control). Cuantificación relativa entre los grupos se calcula utilizando el método ΔΔ C t. En de GenEx, haga clic en la pestaña de procesamiento previo y seleccione la cuantificación relativa. En la ventana de seleccionar el grupo de referencia y pulse Aplicar. Tenga en cuenta que para representaciones gráficas y / o para otros análisis estadísticos, exprEssion datos deben ser convertidos a una escala logarítmica. En el menú de procesamiento previo, seleccione Log2. </li></ol> 2.3.3. Análisis estadístico Software de GenEx permite una amplia gama de análisis estadísticos, entre ellos T-test y ANOVA. <ol><li> Cargue el archivo mdf final al de GenEx y gestor de datos abierta. Es fundamental para seleccionar las muestras correctas o grupos de muestras para las que se realiza el análisis estadístico. </li><li> Seleccione &quot;Estadísticas&quot; y elegimos el icono correspondiente a la prueba deseada. </li><li> Haga clic en &quot;Ejecutar&quot; en la ventana del panel de control. Guardar los resultados como Excel o archivos mdf. </li></ol> 2.3.4. De perfiles de expresión Los microARNs y muestras se pueden clasificar, agrupar, y visualizados a fuego mapas y dendrogramas, de la siguiente <ol><li> Cargue el archivo mdf final al de GenEx y gestor de datos abierta. Utilice esta ventana para seleccionar y crear grupos de muestras o miRNAs. Haga clic en &quot;Aplicar&quot; cuando haya terminado. </li> &lt;li&gt; En la esquina izquierda selecto grupo superior y haga clic en el icono de mapa de calor </li><li> En la ventana Panel de control, haga clic en &quot;Ejecutar&quot;. El mapa de calor se puede guardar en varios formatos como tiff o bmp, sino que también puede copiar y modificar, según sea necesario. </li></ol>

<ol>
	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los microARNs son pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión génica mediante la inhibición de la traducción y / o la promoción de la degradación del mRNA 2. Debido a su alta estabilidad en condiciones libres de células, los microRNAs se han detectado en muchos fluidos corporales. Además, el perfil de expresión distinta de microRNAs se ha correlacionado con la etapa y / o la progresión en una variedad de cánceres humanos 3-9. Hay varias herramient...

Los microARNs pertenecen a la familia de pequeñas (21-23 nt de longitud) RNAs no codificantes que regulan la expresión de genes después de transcriptionally. microARNs pueden secretarse en el espacio extracelular donde parecen ser relativamente estables. Si bien la determinación de los cambios en la expresión de miRNA puede ser un paso importante hacia la identificación de biomarcadores, la realización de perfiles de miARN y el manejo de una gran cantidad de datos puede ser intimidante. Aquí se describe un protocolo para determinar los cambios en la expresión de miRNA en el líquido cefalorraquídeo (aplicable a otros fluidos corporales) por un tiempo real sensibles PCR. También describe el uso de software para análisis de datos, incluyendo el análisis estadístico y representación gráfica de los resultados. Todo el procedimiento es relativamente fácil y sencillo y, en función del número de muestras que se perfilados y el número de máquinas de PCR en tiempo real disponibles, también relativamente rápidos. La parte experimental requiere precisión en el manejoARN y el pipeteo en placas de 384 pocillos, mientras que la sección de análisis de datos utilizando de GenEx requiere algunos conocimientos básicos en informática y estadística.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Table 3. List of equipment.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Finnpipette Novus Multichannel Pipetter&lt;/p&gt; </td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;p&gt;HH05279&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Finntip Pipette Tips&lt;/p&gt; </td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;p&gt;9400613&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Thermal Cycler C1000&lt;/p&gt; </td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes&lt;/p&gt; </td><td>Biorad</td><td>&lt;p&gt;TLS0801&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Flat Cap Strips&lt;/p&gt; </td><td>Biorad</td><td>&lt;p&gt;TLS0803&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;LightCycler 480 Real-Time PCR System&lt;/p&gt;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;LightCycler 480 Sealing Foil&lt;/p&gt;</td><td>Roche</td><td>&lt;p&gt;04 729 757 001&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Refrigerated Centrifuge 5804R&lt;/p&gt; </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Swing-bucket Rotor, 4-place&lt;/p&gt; </td><td>Eppendorf</td><td>&lt;p&gt;A-4-44&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Bench-Top Mini Centrifuge&lt;/p&gt; </td><td>Fisher</td><td>&lt;p&gt;05-090-100&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Bench-Top Vortex&lt;/p&gt; </td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized&lt;/p&gt; </td><td>Fisher</td><td>&lt;p&gt;02-681-5&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Matrix Reagent Reservoir, 25 ml&lt;/p&gt; </td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;p&gt;8093&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Thermomixer Confort&lt;/p&gt; </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15&lt;/p&gt;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Bench-Top Vortex&lt;/p&gt; </td><td>Velp Scientifica</td><td>&lt;p&gt;F202A0173&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Table 4. List of reagents.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns&lt;/p&gt; </td><td>Exiqon</td><td>&lt;p&gt;203300&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml&lt;/p&gt; </td><td>Exiqon</td><td>&lt;p&gt;203400&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free&lt;/p&gt; </td><td>Invitrogen</td><td>&lt;p&gt;10977-015&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R&lt;/p&gt; </td><td>Exiqon</td><td>&lt;p&gt;203608&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations&lt;/p&gt;</td><td>Ambion</td><td>&lt;p&gt;AM1556&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;MS2 RNA carrier&lt;/p&gt; </td><td>Roche Applied Science</td><td>&lt;p&gt;10165948001&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;2-mercaptoethanol 98%&lt;/p&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&lt;p&gt;M3148-25ml&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Ethanol 100%&lt;/p&gt; </td><td>Carlo Erba</td><td>&lt;p&gt;64-17-5&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Nuclease free water&lt;/p&gt; </td><td>Qiagen</td><td>&lt;p&gt;1039480&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;RNAse Zap&lt;/p&gt;</td><td>Ambion</td><td>&lt;p&gt;AM9780&lt;/p&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> Los microARNs (miRNAs) constituyen una capa potente de la regulación de genes guiando RISC en los sitios diana situados en ARNm y, por consiguiente, mediante la modulación de su represión de traducción. Cambios en la expresión de los genes miARN se han demostrado estar involucrados en el desarrollo de todas las principales enfermedades complejas. Por otra parte, los recientes hallazgos mostraron que los miRNAs pueden ser secretadas al medio extracelular y entran al torrente sanguíneo y otros fluidos corporales en los que pueden circular con alta estabilidad. La función de dicho miRNAs circulantes permanece en gran medida difícil de alcanzar, pero los enfoques de alto rendimiento sistemáticas, tales como arrays miARN perfiles, han llevado a la identificación de los genes miARN firmas en varios estados patológicos, incluyendo los trastornos neurodegenerativos y varios tipos de cánceres. En este contexto, la identificación de perfil de expresión de los genes miARN en el líquido cefalorraquídeo, como se informa en nuestro estudio reciente, hace miRNAs candidatos atractivos para el análisis de biomarcadores. _content &quot;&gt; Hay varias herramientas disponibles para crear perfiles de microRNAs, como microarrays, cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR), y la secuencia de profundidad. A continuación, describimos un método sensible para perfilar microRNAs en líquido cefalorraquídeo por cuantitativa en tiempo real PCR. Nosotros utilizado los Exiqon microARN PCR paneles humanos-listas para usar I y II V2.R, que permite la detección de 742 microARNs humanos únicos. Realizamos los arrays en carreras por triplicado y se procesaron y analizaron los datos utilizando el software de GenEx Professional 5. El uso de este protocolo, se ha perfilado con éxito microRNAs en diversos tipos de líneas celulares y células primarias, CSF, plasma y tejidos embebidos en parafina fijado en formol.

Los resultados de este estudio han sido publicados anteriormente 1. Figura 1 muestra los resultados del análisis de microRNAs de referencia candidatos usando la aplicación geNorm. En consecuencia, dos microARN, miR-622 y miR-1266, fueron identificados como genes de referencia y se utilizaron para normalizar los valores de miRNA. Para el estudio del LCR teníamos tres grupos de muestras: VIH (n = 10), HIVE (n = 4), y VIH + sin Encefalitis (VIH +...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR at JoVE.com

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K vistas.  LSU Health Sciences Center.  Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido. 

Video: Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Investigación

Bioingeniería

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Biología del Desarrollo

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Genética

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Medicina

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Bioquímica

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Inmunología e Infección

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biología

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...