Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de subvención NSF-IOS Nacional N º 1144391 de SHB.

1. Preparación de Plantas <ol><li> Semillas de Arabidopsis se pueden germinaron directamente en el suelo o sobre placas de MS. Cultivar las plantas de cuatro a seis semanas en cámaras de crecimiento con un fotoperíodo de 12 horas (22 ° C el día, 15 ° C la noche 14). Las plantas de agua una o dos veces a la semana. Utilice la bandeja inferior para riego; qué no plantas de agua desde la parte superior, permiten que las bandejas que se seque antes de volver a regar. Asegúrese de que las plantas estén bien hidratados en el momento de la cosecha. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones y platos <ol><li> K-EDTA solución 2: Haga una mM K 2-EDTA solución solución de 100 acciones, que se puede guardar en el refrigerador. En el día de la recogida, se diluye la solución de un solo a cinco (una solución de EDTA parte, cuatro partes de agua) para obtener una solución de 20 mM de K 2-EDTA. </li><li> Llene un vaso o una placa de Petri (diámetro de 7-15 cm) hasta la mitad con la solución de 20 mM K 2-EDTA. Si la recogida de muestras de diferentes tratamientos (por ejun amplio control y las plantas de sal estrés o diferentes genotipos), preparan platos separados para cada tratamiento. </li><li> Llenar número deseado de tubos de reacción de 1,7 ml con 1,4 ml de solución de 20 mM de K 2-EDTA. Llenar un número igual de tubos de reacción con 1,4 ml de agua desionizada autoclave o Millipore. </li><li> Ponga toallas de papel en el banco para establecer plantas de, obtener una nueva hoja de afeitar y se puso los guantes. </li></ol> 3. Colección de floema exudados (Representado en el Diagrama de flujo en la Figura 1) <ol><li> Cosechar las hojas de roseta de cuatro a seis semanas de edad, las plantas cortándolos con la hoja de afeitar en la base del pecíolo cerca del centro de la roseta. </li><li> Coloque inmediatamente las hojas de los platos que contienen 20 mM K 2-EDTA. Asegúrese de que el extremo cortado del peciolo se sumerge en la solución (Figura 2). </li><li> Una vez que se han recogido 15 hojas (aproximadamente tres y cincuenta y siete plantas), la pila con cuidado las hojas en la parte superior de uno al otro como tsombrero pecíolos el corte están alineados uno con el otro. Volver a cortar la base de los pecíolos (ca. 1 mm) y transferir inmediatamente las hojas en uno de los tubos de reacción con la solución de 20 mM de K 2-EDTA. Las hojas se ajustan más fácil si están ligeramente enrolladas. Evite apretar las hojas en ya que esto puede causar lesiones de las células y, por lo tanto, conduce a la colección del extendido de la hoja. </li><li> Si se necesita más material, cubra suavemente las muestras con una toalla de papel húmeda. Utilice un nuevo conjunto de platos, si para la recogida de muestras de diferentes tratamientos o genotipos. </li><li> Una vez que todas las muestras se colocan en tubos de reacción, recoger los exudados, ya sea en la oscuridad o en la luz. </li><li> Para la recogida en la oscuridad, la línea del piso de un gran plato hondo con toallas de papel mojadas. Coloque el bastidor con los tubos de reacción de hojas llenas en el plato y bien cubierta con toallas de papel húmedo o poner en una parte trasera de plástico negro con aberturas de aireación. Toda la instalación en un armario o una habitación oscura. </li><li> Para la recolección de la luz, cubrir el fondo de un recipiente de plexiglás transparente con toallas de papel mojadas. Coloque el bastidor con los tubos de reacción de hojas llenas en el recipiente y cerrarlo. </li><li> Después de 1 hora, quitar las hojas con cuidado desde el contenedor y los tubos de reacción y lavar a fondo con agua destilada, desionizada o Millipore para eliminar todo el EDTA. Este paso sirve para tres propósitos: (1) que elimina el EDTA para minimizar el daño a las células, (2) que elimina la interferencia de EDTA con SDS-PAGE y cromatografía, y (3) elimina los compuestos que se han acumulado a partir de corte / dañado las células. Transferir inmediatamente a los tubos de reacción preparados que contienen agua tratada en autoclave y volver a los contenedores de recogida humedecidas para la recogida de exudados. En este punto, añadir inhibidor de RNasa si el exudado necesita ser utilizado para la extracción de ARN. Opcional: inhibidor de la proteinasa puede ser añadido si se desea el análisis de proteínas. </li><li> Después de la hora de recogida previsto, sacar y discaª las hojas y congelar los exudados del floema en N2 líquido para su uso posterior. Si se necesita un almacenamiento prolongado, liofilizar las muestras y almacenar a -80 ° C. </li><li> En el caso de Arabidopsis, ya metabolitos pueden ser detectados después de la recogida de exudados durante 1 hora. Sin embargo, la colección de 5-8 horas es aconsejable si se prevé el análisis de los componentes menos abundantes. Para las plantas más grandes como Perilla, se recomiendan tiempos de recogida más largos (8 h). Exudado recogido de 15 hojas es normalmente suficiente para un carril en un gel de SDS-PAGE (proteínas), para la extracción de ARNm, GC-MS (azúcares y metabolitos). Para el análisis de los lípidos de la puesta en común de 2-3 muestras (exudado 30-45 hojas) se recomienda y conduce a resultados más claros. </li></ol> 4. Análisis posteriores (para vídeo sólo mostramos 4.4) <ol><li> Para el análisis de proteínas, muestra de resuspender en 15 l de agua y 30 l tampón Lämmli, calentar a 95 ° C durante 5 min, girar rápidamente por cualquier precipitates y cargar totalidad de la muestra en un gel de SDS-PAGE (45 bolsillos de carga l). Las muestras se tiñeron con Coomassie coloidal u otras manchas sensibles desde la abundancia de proteínas es muy bajo. </li><li> Para el azúcar y el análisis de metabolitos pequeña, añadir agentes de derivatización de la muestra seca como se describe en la literatura 14. </li><li> ARNm puede ser analizada mediante RT-PCR, el análisis de microarrays o ARN-Seq. </li><li> Para el análisis de lípidos inmediatamente piscina dos y cincuenta y ocho muestras de partición y contra cloroformo: metanol (01:01) en la campana de humos de la siguiente manera: añadir una cantidad igual de cloroformo: metanol a cada muestra, de vórtice durante unos pocos segundos, y se centrifuga durante 4 min a 400 x g. Recoger la fase inferior (orgánica) en un tubo de vidrio con tapa de teflón y la partición de repetición con la fase superior tres veces más. Se secan las fases orgánicas reunidas bajo una corriente de N 2 y someter a análisis adicional (cromatografía en capa fina: TLC 14, 37; cromatografía líquida espectrometría de masa: LC-MS 14). </li></ol>

No tenemos nada que revelar.

La colección de EDTA-facilitado de floema exudados es muy simple, necesita un mínimo de equipo, y es aplicable a la mayoría de las plantas. En general, este método se extiende a la capacidad de analizar exudados del floema de más especies. A pesar de que el exudado se diluye, que es fácil de recoger muchas muestras diferentes o de muchas plantas a escala hasta una gran cantidad de material. Esto entonces permite la detección de nuevos compuestos que se encuentran en muy baja abundancia y de otro modo se pasan por alto. Este método puede ser utilizado para múltiples especies de plantas y funciona como se describe para los que se enumeran en este manuscrito. Si se exploran nuevas especies, los dos aspectos que podrían necesitar modificaciones son el número de hojas utilizadas y el tiempo de la exudación. En la mayoría de los casos, una hora exudación siete y cincuenta y cinco debe ser adecuado. Para confirmar el uso de este método para una nueva especie vegetal, exudado necesita ser recopilada y uno o más de los análisis posterior tal como se describe en el protocolo de la parte 4 nECESIDADES a realizar. Dependiendo de la intensidad de la señal observada, puede necesitar ser reducido hasta el volumen de recogida. En general, los lípidos y análisis de proteínas se requieren más material que el análisis de azúcar y el metabolito ya que los primeros son menos abundantes en los exudados del floema. Debido a que el exudado de la colección de EDTA-facilitado consiste en superficies de corte, así como un efecto potencialmente dañino de EDTA, varios puntos tienen que ser considerados: (1) después de la una hora de incubación con EDTA, los pecíolos tienen que ser lavado a fondo. Esto elimina cualquiera de los compuestos obtenidos a partir de células heridos, así como el propio EDTA, lo que podría dañar las células o interferir con la extracción. (2) Los controles positivos y negativos deben ser incluidos para asegurar que los datos obtenidos se derivan de la savia del floema y no de las células dañadas (ver pasos críticos a continuación). (3) savia del floema contiene varias enzimas, que podrían ser activa durante la recogida de exudado. Por lo tanto, en algunos casos, puede ser útil para recoger FOr diferentes cantidades de tiempo. (4) Dado que el método implicaba exudación en agua, una cuantificación absoluta de los compuestos no es posible. Los pasos críticos: La clave para el uso exitoso de este método es el uso de precauciones durante la manipulación de la muestra no debe dañar a las células, así como el uso de controles apropiados (véase la referencia 14.). Un control adecuado es la colección de exudados del floema sin tratamiento previo con EDTA. En este caso, el floema sellará en sí y no hay exudado puede ser recogido. Cualquier compuestos contaminantes procedentes de las células heridos serán detectados aquí. Un segundo control sería el análisis de los azúcares en el exudado. En Arabidopsis, sacarosa debe ser el metabolito predominante dentro de la savia del floema, con fructosa a la relación de sacarosa de 01:04-01:08 (ref 8, 14). Para la extracción de ARN es necesario el uso de un inhibidor de RNAsa. Además, un control positivo de los anteriormente describiendoed ARNm floema-localizada (UBC9: enzima de conjugación de ubiquitina 9, At4g27960; 8, 14) y un control negativo de por ejemplo un ARNm cloroplasto (Rubisco LSU) son aconsejables. Debido a que el exudado contiene enzimas activas, un curso de tiempo se aconseja para asegurar que los cambios en el perfil de floema no son simplemente debido a las variaciones en el tiempo de recogida. En algunos casos, puede ser beneficioso utilizar inhibidores de proteinasas. Sin embargo, los investigadores deben tener en cuenta, que el exudado recogido se concentra y que los compuestos añadidos se concentran en gran medida. Un segundo paso crítico en el protocolo es el recutting del pecíolo bajo EDTA. Este paso tiene un doble propósito: en primer lugar, que elimina cualquier placa de tamiz sellados mientras que la prevención de la formación de nuevas bujías permitiendo así la libre circulación de la savia del floema. En segundo lugar, se elimina la burbuja de cavitación en el xilema generado durante el corte y por lo tanto permite el transporte xilema. El tamaño de la segunda corte dependes de las plantas utilizadas. En las plantas con pecíolos más grandes que debería ser de varios milímetros (hasta 1 cm) por encima del primer corte, en plantas como Arabidopsis, 1-2 mm son suficientes. El uso de este método puede conducir al descubrimiento de nuevos compuestos en los exudados del floema que podría haber de señalización, consecuencias para el desarrollo o biomédica. Se ha impulsado una mirada más profunda a la señalización de lípidos de larga distancia, que era un campo poco estudiado dentro de la ciencia de la planta debido a la falta de acceso al floema.

Las plantas no pueden moverse para escapar de condiciones adversas. Por lo tanto, tuvieron que desarrollar mecanismos para detectar el estrés ambiental, obtener y transmitir una señal relacionada con toda la planta, y ajustar en consecuencia el desarrollo. Existen dos sistemas de transporte para la distribución de agua, nutrientes y otros compuestos (señalización). El primero es el xilema; que normalmente transporta agua y minerales absorbidos por las raíces en toda la planta. El segundo es el floema. La vista de la floema ha cambiado de un sistema de transporte asimilar sencilla a un conducto para el ARN, proteínas, virus, lípidos y otras moléculas pequeñas. Desempeña un papel importante en la asimilación y transporte de nutrientes, la respuesta al estrés biótico y abiótico, así como en el crecimiento y desarrollo de plantas. Ahora se llama la &quot;supercarretera de la información&quot; de la planta 18. El floema se compone de varios tipos de células: parénquima del floema, así como compañero especializada ceLLS y elementos de tamiz. El elemento de tamiz es el sitio del movimiento de larga distancia. Para permitir el flujo sin obstáculos longitudinal, elementos de tamiz están perdiendo la mayoría de los orgánulos, así como núcleos y se cree que contienen en el mejor de una maquinaria de traducción limitada 21, 33. Se cree que las células de compañía sintetizan proteínas y otros compuestos, que viajan en la corriente de floema. Estos compuestos son entonces transportados en el elemento de tamiz a través de los plasmodesmos y pueden funcionar como señales de larga distancia 4,16. Varios grupos de compuestos se pueden encontrar en los exudados del floema: <ul><li> Los azúcares son con frecuencia los productos de la fotosíntesis y son transportados como &quot;portadora de energía&quot; moléculas a otras partes de la planta para el almacenamiento o como bloques de construcción. Sin embargo, también pueden funcionar como anticongelante o como compuestos de señalización. </li><li> Las proteínas también se pueden encontrar en los exudados del floema. Ellos incluyen enzimas metabólicas, sino también tener una función de señalización. Una exampLe de una proteína que sirve como una señal de desarrollo es la proteína T locus de floración, lo que indica la inducción de la floración, así como abscisión de las hojas en las plantas de temporada. 6 </li><li> Los ácidos nucleicos que están presentes en los exudados del floema en forma de ARNm, ARN pequeños y micro, y ARN virales. Ellos parecen estar implicadas en gran medida en la señalización 27, 28, 39. Al mismo tiempo, ARNr y ARNt para casi todos los aminoácidos se han observado en la savia del floema de las cucurbitáceas 42. Parecen ser transferida selectivamente en el sistema de tubo de tamiz. Los ARNt muestran modificaciones necesarias para la capacidad de transferencia de aminoácidos para el aparato de traducción. Sin embargo, en lugar de participar en la traducción, que parecen inhibir este proceso. Alternativamente, podrían servir como una fuente de citoquinina o señalar el estado metabólico de la planta 42. </li><li> Los ácidos grasos, Oxylipins, y otros lípidos también se han encontrado en el floema exudados 3, 13, 14, 23. Jasmoácido NIC, un oxylipin mueve a través del floema como parte de la respuesta a la infección por patógenos 22, 29, 31, 32. Mientras que el papel de la mayoría de los lípidos del floema todavía no está claro, algunos de ellos probablemente tienen una función de señalización 4. </li></ul> El desafío en el trabajo con el floema de plantas reside en su capacidad para sellar heridas a sí mismo. Hay cuatro métodos principales que se utilizan para recoger exudados del floema, sin embargo, sólo funcionan en especies seleccionadas: 1) En cucurbitáceas es posible obtener cantidades razonables de floema exudado a través de recortes de la pecíolo. Una vez que la caída inicial con la contaminación de las células lesionadas se retira, es posible obtener cantidades razonablemente grandes de pura savia del floema 1, 15. Sin embargo, con el aumento de tiempo de recogida, este exudado se espesa, por lo que es cada vez más inadecuados para enfoques de cromatografía de líquidos (no publicado). Publicaciones recientes sugieren, que dependiendo de la especie, esta savia del floema se deriva de either la fascicular (FP) o la extrafascicular floema (PE) y que, mientras que sí contiene &quot;móvil&quot; savia del floema de los elementos de tamiz (FP), que también es propenso a la contaminación de otros tipos de células, incluyendo el xilema 40, 41 . 2) Un segundo enfoque es el de obtener savia del floema a través de cortes poco profundos o punciones en tallo o pecíolo. Este método ha sido utilizado con éxito en altramuz 17, 25, 36 cucurbitáceas, y Brassica napus 12. Aquí la contaminación de las células lesionadas es mínimo y los exudados muy puro. Sin embargo, las plantas necesitan para estar sanos y bien regada, ya que es muy difícil para perforar selectivamente sólo los elementos cribosos. Si están mellados vasos del xilema, todos exudado es arrastrado en el flujo de xilema. Esto hace que el método adecuado para plantas con pecíolos o tallos muy frágiles o altamente lignificada. 3) stylectomy áfidos pulgones permite insertar su estilete en los elementos cribosos deln retirar el pulgón con un láser. Savia del floema es exudada a través de la restante estilete 2, 9, 10, 35, 38. En teoría, cualquier planta que puede ser infectado por los áfidos se puede utilizar para este enfoque. Sin embargo, la mayoría de invernadero o administradores de cámara de crecimiento no apoyará el uso de un agente patógeno. Además, los áfidos introducen varias proteínas en el floema con su saliva 19, 33. Esto conduce a una reprogramación transcripcional limitada 30 y tiene el potencial de cambiar la composición del floema 26. 4) El método descrito aquí es la exudación EDTA-facilitado de savia del floema. Este método emplea EDTA para evitar la obturación del floema 20. EDTA quelatos de iones Ca 2 + que participarían de otra manera en los procesos que sellan el floema. Mientras que el EDTA puede conducir a daño celular 30, varios grupos han utilizado este método y se observó ningún efecto adverso de las concentraciones de EDTA de 10 mM a 20 mM sobre la ultraestructura de células o en phloem carga y transporte 5, 24. Para reducir cualquier efecto perjudicial así como la interferencia de EDTA con cromatografía y electroforesis en gel, las plantas se mueven en el agua después de 1 h, y sólo la parte posterior de la exudado se utiliza 14. Por lo tanto, en lugar de exudación en EDTA, floema se exudados en agua (EDTA-facilitado exudación). Se trata de un sencillo, de bajo costo y baja tecnología, método para la recogida de exudados del floema. Savia del floema obtenidos de este modo se puede utilizar para analizar las proteínas, moléculas pequeñas, lípidos, y ARN y se ha utilizado con éxito en muchas plantas. Si bien una cantidad limitada de experimentos se ha realizado en monocotiledóneas 11, el método parece ser más adecuado para las dicotiledóneas (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, álamo 7). Colección de exudados tiene que ocurrir en un ambiente húmedo para evitar la pérdida de exudados a través de la transpiración. Dependiendo de la planta, la incubación en EDTA durante una a dos horas essuficiente para evitar el sellado de los elementos del floema / tamiz. La colección, entonces puede ocurrir en agua. Esto tiene la ventaja de evitar el efecto negativo de EDTA tiene en la estructura celular y la estabilidad. También elimina la interferencia de EDTA con métodos como HPLC o SDS-PAGE. Se muestra como se aplica a Arabidopsis. Para las plantas más grandes, la incubación en EDTA y exudado colecciones tiene que ser ampliado y se realiza en vasos y no en tubos de reacción de 1,7 ml.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm)</td><td>PYREX or Corning</td><td></td><td>Any clean, shallow dish will work</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Only open containers in fume hood</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

El floema de plantas es esencial para el transporte de larga distancia (foto-) asimila, así como de transmitir señales de estrés biótico o abiótico. Contiene azúcares, aminoácidos, proteínas, ARN, lípidos y otros metabolitos. Aunque hay un gran interés en la comprensión de la composición y la función del floema, el papel de muchas de estas moléculas y, por tanto, su importancia en el desarrollo de la planta y la respuesta de estrés aún no se ha determinado. Una barrera para el análisis de floema radica en el hecho de que los propios sellos del floema sobre hiriendo. Como resultado, el número de plantas de las que savia del floema puede obtenerse es limitada. Un método que permite la recogida de exudados del floema a partir de varias especies de plantas sin el equipo añadido es la colección de EDTA facilitado por floema exudado se describe aquí. Si bien es fácil de usar, que hace lugar a las heridas de las células y el cuidado tiene que ser tomado para eliminar contenidos de las células dañadas. Además, varios controles para demostrar la pureza del exudadoson necesarios. Debido a que es una exudación en lugar de una colección directa de la savia del floema (no es posible en muchas especies) sólo cuantificación relativa de sus contenidos puede ocurrir. La ventaja de este método sobre los demás es que puede ser utilizado en muchas especies de plantas herbáceas o leñosas (Perilla, Arabidopsis, álamo, etc) y requiere un mínimo de equipo y la formación. Esto conduce a cantidades razonablemente grandes de exudados que pueden ser utilizados para el análisis posterior de proteínas, azúcares, lípidos, ARN, virus y metabolitos. Es bastante simple que se puede utilizar en una parte de investigación, así como en un laboratorio de enseñanza.

Se ha hecho evidente en los últimos años que la complejidad de la savia del floema puede ser la respuesta a la pregunta de cómo las plantas envían señales que varían en el desarrollo y el estrés de respuesta óptima. El uso de EDTA facilitado exudación floema puede proporcionar la oportunidad de analizar los exudados del floema de las plantas que no son adecuadas para otros enfoques, pero puede ser de interés económico o fisiológico. Este método permite la cosecha de floema exudados suficiente para identificar las proteínas floema-localizados y detectar cambios en su nivel en respuesta al desarrollo o el estrés (Figura 3). Como muestra la figura, las proteínas se encuentran en muy baja abundancia, sin embargo, su nivel es lo suficientemente alto como para proteómica experimentos posteriores utilizando LC-MS/MS o para el análisis de Western blot. Los hallazgos en cucurbitáceas sugieren que el corte del vástago conduce a una ruptura del equilibrio potencial de agua y una afluencia posterior de agua yposibles contaminantes desde el apoplasto 41. Sin embargo, para los tiempos de recogida que van desde una a ocho horas no afecta el perfil floema proteína / composición en Arabidopsis (. Sólo la cantidad absoluta varía Guelette et al), la cantidad de proteína recogida y el patrón de proteínas que se encuentran varía entre las especies (Arabidopsis: A, Perilla, carril I y NI) y tratamientos (Perilla cultiva en diferentes longitudes de día, carril I y NI). Como resultado, las señales proteicas se pueden visualizar, identificados y seguidos. ARNm y micro ARN también se pueden identificar en los exudados del floema por este método. Sin embargo, el tratamiento con inhibidor de ARNasa es necesario para prevenir la degradación del ARNm durante el tiempo exudación extendida. Puesto que los elementos de tamiz no contienen cloroplastos funcionales, pequeña de Rubisco o subunidad grande (glóbulos rojos o rbcL, respectivamente) los ARNm pueden utilizarse como controles negativos, mientras que conocida floema-Localizada ARNm como enzima de conjugación de ubiquitina puede ser utilizado como un control positivo (Figura 4). Del mismo modo, azúcares o pequeñas metabolitos pueden ser analizados utilizando GC-MS o LC-MS. Aquí se debe mencionar que los exudados del floema contienen un gran número de enzimas funcionales, incluyendo casi la totalidad de la vía glucolítica 12. Por lo tanto, el uso de varios puntos de tiempo puede revelar procesos metabólicos durante la recogida de exudado. Un ejemplo se muestra en la Figura 5: En todos los exudados, la sacarosa es el metabolito más abundante, lo que es más evidente después de una colección durante 1 hora. Sin embargo, después de cinco horas, la relación de sacarosa a fructosa se reduce ligeramente. Si el exudado de la misma se recoge durante una hora y se dejó en el banco para los siguientes cuatro horas, la relación de sacarosa a fructosa se reduce en un grado mucho mayor, lo que sugiere que las enzimas activas en el floema exudados conducen a una degradación de la sacarosa a temperatura ambientetura (para más interpretaciones pico ver 14). Esto es consistente con los hallazgos que floema carga y el transporte de moléculas a partir de células acompañantes en los elementos de tamiz pueden continuar durante exudación hasta que el sistema pierde su vitalidad 34. Los lípidos en los exudados del floema y, por extensión, de señalización de lípidos de larga distancia son un campo relativamente reciente de interés en la ciencia de las plantas. Debido a sus lípidos naturaleza hidrófoba sólo están presentes en bajas concentraciones y se puede unir a otras moléculas para la solubilización. Sin embargo, la exudación de EDTA-facilitado permite la colección de material suficiente para visualizar (TLC; Figura 6) e identificar (LC-MS; Figura 7) los lípidos del floema de varias especies de plantas. Como muestra la figura, es posible identificar y separar varias especies de lípidos. LC-MS permite identificar las diferentes especies de lípidos y para monitorear los cambios en el perfil lipídico de diferegenotipos nt o tratamientos. Esto permite el estudio del papel de los lípidos durante el desarrollo de la planta y la respuesta al estrés. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Diagrama de flujo de la colección de floema exudados de Arabidopsis o Perilla. Diferentes caminos conducen a diferentes productos finales, que se indican en azul. Para la preparación de ARN, inhibidor de ARNasa (100 U / ml, Roche) se añade al agua en la que se recoge el exudado floema. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Configuración de los materiales de floema exudado recogerde iones. La instalación muestra todos los materiales necesarios para los pasos del protocolo 3.1 a 3.4. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 Proteínas que se encuentran en el floema exudados de dos especies diferentes de plantas de Arabidopsis, (A) y (I Perilla y NI; diferentes longitudes días); MW: marcador de peso molecular (carril 2). Las proteínas se separaron usando un gradiente de 10-20% de SDS-PAGE. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Análisisde la presencia de ARNm para la pequeña de Rubisco y la subunidad grande (los glóbulos rojos y rbcL, respectivamente) y la enzima de conjugación de ubiquitina (UBC). ARNm se recogió a partir de hojas de Arabidopsis (L), pecíolos (P), y los exudados del floema (Ph), revertir transcripciones transcritas y específica visualizaron utilizando PCR. La figura fue modificado a partir Guelette et al. 14. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Perfil de GC-MS del floema exudados recogidos para diversa cantidad de veces. Tenga en cuenta cómo la cantidad relativa de los cambios de sacarosa a partir de 1 hora de recogida (A) a 5 horas de tiempo de recogida (B). Exudado perfil después de la recolección durante 1 hora seguido de &quot;incubación&quot; en la sala<html> temperatura (RT) durante cuatro horas (C). Hoja perfil de metabolito (D). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Cromatograma en capa fina comparando los lípidos de Perilla (izquierda) y hojas de Arabidopsis (derecha) y exudados del floema. Los asteriscos indican los lípidos específicos para exudados del floema. DGDG: digalactosildiacilglicerol; PG: fosfatidilglicerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; La parte de la figura mostrando lípidos Arabidopsis ha sido modificado desde Guelette et al 14.. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. Perfil lipídico de floema exudados de Arabidopsis (cloroformo fase) utilizando LC-MS / modo de iones negativos. Los gráficos en la parte superior (mutante, A) y la parte inferior (de tipo salvaje, B) muestran las diferencias en los perfiles de lípidos entre los dos genotipos diferentes (indicadas por flechas). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

El conocimiento de la composición de la savia del floema, así como el mecanismo de su transporte de carga y de larga distancia es esencial para la comprensión de la señalización de larga distancia en el desarrollo de la planta y el estrés / respuesta patógeno y de transporte de asimilados. Este manuscrito describe la colección de exudados del floema utilizando el método de EDTA-facilitado.

Recopilación y análisis de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exudados mediante el método de EDTA-facilitado

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

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Video: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol aims to introduce general guidelines for the collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) on metabolite production. First, alfalfa seedlings are grown under DEHP stress in a hydroponic culture experiment. Second, the plants are transferred to centrifuge tubes containing 50 mL of sterilized ultrapure water for 6 h to collect root exudates. The solutions are then freeze-dried in a vacuum freeze dryer. The frozen samples are extracted and derivatized with bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA) reagent. Subsequently, the derivatized extracts are measured using a gas chromatograph system coupled with a time-of-flight mass spectrometer (GC-TOF-MS). The acquired metabolite data are then analyzed based on bioinformatic methods. Differential metabolites and significantly changed metabolism pathways should be deeply explored to reveal the impact of DEHP on alfalfa in view of root exudates.

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

The secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol describes how to assess the impact of xenobiotics on alfalfa via nontargeted metabolomic analysis.

Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

Investigación

Medio ambiente

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

Estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Bioquímica

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biología

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análisis específico de célula de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Hojas usando citometría de flujo

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Como ejemplo

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Muestreo de Sap de líber de Brassica napus para 3D-página de proteínas y complejos de ribonucleoproteína

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Análisis del comportamiento de crecimiento de Arabidopsis thaliana en diferentes calidades de luz

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Cinta-cáscara de estomas: Un método mejorado para la preparación de la muestra de protector de la célula

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Un método mejorado para medir los perfiles de hidratación del polen en Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Autor destacado: Un bioensayo de hidratación de polen in vivo de alta resolución, de un solo grano para Arabidopsis thaliana  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Un bioensayo de hidratación de polen in vivo de grano único de alta resolución para Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

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Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos

Estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana

Análisis específico de célula de

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de

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Análisis del comportamiento de crecimiento de Arabidopsis thaliana en diferentes calidades de luz

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