Damos las gracias al Dr. Song Yijun, y los miembros de la Hattar Kuruvilla Zhao tri-laboratorio del Departamento de Biología de la Universidad Johns Hopkins de consejo y ayuda. Apoyado por subvenciones del NIH DC007395 y DC009946.

Parte 1. La grabación EOG configuración El aparato de grabación consiste en un electrodo de registro, electrodo de referencia, el tubo de suministro de aire, la etapa de muestras, y el microscopio de disección, todos anclados en una mesa de aire dentro de una jaula de Faraday. Micromanipulador se utilizan para la colocación de los electrodos y el tubo de suministro de aire. Un flujo continuo de aire se hace pasar por agua destilada para añadir humedad antes de pasar por el tubo de aire y sobre la muestra. Un plato de cultivo de 60 mm llena de Sylgard a una profundidad de 8.6 mm se utiliza como superficie de montaje de la muestra. Un pozo y un canal están excavadas en la Sylgard en el plato de montaje para proporcionar un medio para conectar eléctricamente el electrodo de referencia de la muestra a través de la solución de Ringer modificada. El electrodo de registro y el electrodo de referencia se conecta a un amplificador. Las señales de que el amplificador se envían a un digitalizador y luego a una computadora. Software como Axograph o pCLAMP se puede utilizar para controlar el protocolo de estimulación, para grabar la señal, y para su posterior análisis de las respuestas. Un osciloscopio conectado después de que el amplificador puede ser conveniente para monitoreo en tiempo real del potencial eléctrico al colocar el electrodo de registro y durante las grabaciones EOG. La entrega de los estímulos de olor es controlado por un Picospritzer, que se conecta al mismo equipo utilizado para la adquisición de la señal. La presión de aire en el Picospritzer se establece en 10 psi. Un tanque de aire y el regulador solo se puede utilizar para suministrar aire a la tabla de aire y la Picospritzer. Un segundo tanque de aire y el regulador se utiliza para proporcionar aire para el flujo de aire húmedo, ya que esto requiere una presión más baja y una gran cantidad de flujo de aire. Justo antes de la entrega de un estímulo de olor, la salida Picospritzer está conectado a una botella de olor. La botella de olor se conecta al tubo de suministro de aire. Parte 2: Preparación de electrodos El electrodo de registro es un alambre de plata cloruradas en un vaso capilar sacó llena con solución de Ringer modificadas (135 mM NaCl, 5 KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4, esterilizada por filtración). El electrodo de referencia es un hilo de plata cloruradas. <ol><li> Instalar alambre de plata en el soporte de los electrodos. Para el electrodo de registro, uno a dos centímetros de alambre que sobresalen del extremo del soporte de los electrodos. Más de alambre se puede dejar para el electrodo de referencia. </li><li> Para añadir la capa de AgCl que el alambre de plata, la posición del cable en 0,1 M NaCl y conectar el soporte del electrodo al polo positivo de una fuente de 1.5 a 9 V de corriente continua. El polo negativo de la fuente de alimentación debe estar conectado eléctricamente a la solución 0,1 M de NaCl. Permitir que la reacción chloriding proceder durante 10 minutos. Para igualar la energía estática entre la grabación y el electrodo de referencia, brevemente los electrodos juntos antes de instalarlas en el aparato de grabación. </li><li> Tirar un vaso capilar mediante un extractor de micropipeta. La abertura en la punta del capilar debe ser alrededor de 5-10 micrones de diámetro. </li><li> Use un lápiz de diamante para marcar y romper el extremo romo de los capilares por lo que es de ~ 2 cm más largo que el alambre de plata. Fuego pulir el corte final con la antorcha de butano. </li><li> Derretir el 0,5% de agarosa en una solución de Ringer modificada. Tirar de una pequeña cantidad de solución de agarosa fundida en la punta del electrodo con una pipeta de transferencia. </li><li> Llenar el capilar retiró aproximadamente 1 / 2 de la forma con la solución de Ringer modificada (una jeringa que se ha calentado y sacó a tener un final largo y fino es útil para este propósito). Agitar suavemente el tubo capilar para eliminar burbujas de aire. Guarde el electrodo lleno en el frasco de almacenamiento con una pequeña cantidad de solución de Ringer modificada en la parte inferior hasta que están listos para ser utilizados. Una vez que una muestra de tejido está preparado y listo para grabar, instalar un capilar lleno sobre el alambre electrodo de registro. </li></ol> Parte 3: Preparación de las soluciones de olor El acetato de amilo olores y evocar respuestas heptaldehyde grande y por lo tanto son opciones buenas como estimulantes EOG. <ol><li> En tubos de microcentrífuga, preparar una serie de diluciones de olor en dimetilsulfóxido (DMSO). Como punto de partida para una curva dosis-respuesta, preparar diluciones de 10 veces a partir de 5 M a 5 x 10 -6 M. Hacer diluciones frescas cada día. </li><li> Volver a diluir los olores de 50 veces en el agua mediante la mezcla de 100 acciones diluidas l en DMSO con 4,9 ml de agua en 2 botellas con tapones de silicona oz. Deje que las soluciones se equilibran en las botellas, por lo menos 30 minutos. Tenga en cuenta que la concentración de vapor de sustancias odoríferas en cada botella se desconoce, pero puede variar en función de la concentración de olores en la fase líquida. </li><li> Insertar dos agujas de calibre 18 a través del tapón de silicona para proveer puertos de entrada y de salida. Los puertos deben estar conectados cuando la botella no está en uso. </li></ol> Parte 4: Registro de los datos y el análisis de EOG <ol><li> Sacrificio de un ratón de CO 2 la eutanasia o la sobredosis de anestesia seguido por decapitación. Quitar la piel que recubre el cráneo y sagital dividir en dos la cabeza a lo largo de la línea media. </li><li> Monte de la mitad de la cabeza, cara medial hacia arriba, sobre el plato de montaje. Retire con cuidado el tabique para exponer los cornetes. </li><li> Coloque el plato con el tejido montado en la etapa de grabación. Alinear el escenario para que el lugar de grabación en los cornetes se centra en el microscopio. </li><li> A su vez en el tanque de aire para proporcionar aire húmedo a la superficie de los cornetes. Coloque el tubo de aire de modo que es de aproximadamente 10 mm de distancia del lugar de grabación. El caudal es de unos 600 ml / min. </li><li> Ajuste el amplificador a modo DC (amplificación AC induce artefactos en la señal EOG) con filtro de paso bajo a 1 kHz, y el aumento en 100 veces. </li><li> Monte de grabación y de referencia en el micromanipulador. </li><li> Baje el electrodo de referencia en el pozo en el plato de montaje y cubrir con una solución de tal manera que está conectado eléctricamente con el tejido modificado Ringer. </li><li> Baje con cuidado el electrodo de registro sobre la superficie del cornete IIb o III. El electrodo debe tocar la superficie del epitelio olfativo! Cuando el electrodo está en contacto con el epitelio (es decir, se completa un circuito eléctrico) una línea de base recta aparecerá en el osciloscopio. </li><li> Coloque una botella de olor para el lado de babor en el tubo de suministro de aire. </li><li> En el equipo, iniciar un protocolo de estimulación. La tasa de muestreo para la adquisición de datos debe ser de 2 kHz o mayor. El software dará lugar a un pulso de olor y comenzar a grabar. </li><li> Un protocolo de estimulación típico puede ser un pulso de 100 mseg de duración única, a la par de 100 mseg pulsos separados por un intervalo de 1 segundo, o 10 segundos de pulso sostenido. </li><li> Espere un tiempo entre los protocolos de manera que el tejido es muy poco adaptadas. Un minuto es suficiente para las concentraciones de líquido de acetato de amilo y heptaldehyde hasta 10 -3 M, en concentraciones más altas permiten 5 minutos. Después de la entrega de altas concentraciones de olor (como al final de una curva dosis-respuesta) olor residual puede permanecer en el tubo. Lave el tubo de aire con un 95% de etanol y seco antes de continuar con las muestras de tejido. </li><li> Axograph software ofrece herramientas para la medición de los parámetros clave de la señal EOG. Estos parámetros incluyen la amplitud de la respuesta, la latencia, el tiempo de pico, y constantes de tiempo de terminación. Puede ser conveniente para filtrar digitalmente las huellas a 25 Hz antes de su posterior análisis. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1. Los parámetros para el análisis de EOG. Varios parámetros de la EOG son particularmente útiles para la comparación de las respuestas entre los ratones, incluyendo la amplitud de respuesta, la latencia (el tiempo entre el momento en que el estímulo se administra y se inicia la respuesta), el aumento del tiempo (el tiempo entre el comienzo de la respuesta y el pico), tiempo hasta el pico (el tiempo desde el inicio de la estimulación a la cima de la respuesta), y la constante de tiempo de terminación (τ, determinado mediante el ajuste de la fase de caída de la respuesta a una ecuación exponencial simple ). Para la comparación de los parámetros cinéticos como la latencia, el tiempo de subida, y la constante de tiempo de terminación, es aconsejable para normalizar la amplitud máxima de las respuestas antes del análisis. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. Representante de las señales de EOG en protocolos de estimulación diferente. (A) Ejemplos de EOGs de un ratón en respuesta a la estimulación con concentraciones crecientes de acetato de amilo. La línea de negro en la parte superior del panel indica el tiempo y la duración de la estimulación olor. Las concentraciones en la leyenda son las concentraciones de la solución líquida. (B) una relación dosis-respuesta promedio de cinco ratones. Las barras de error son del 95% intervalos de confianza. La disminución de la amplitud de pico se observa a menudo en concentraciones olor muy alto. (C) Un ejemplo de EOG en respuesta a una estimulación pareada de pulso. Un solo pulso corto de olor provoca la adaptación que dura varios segundos. (D) Un ejemplo de EOG en respuesta a una de 10 segundos de estimulación sostenida de olor. El EOG muestra desensibilización durante la presentación de olor continuo.

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Los ratones fueron manipulados y sacrificados con métodos aprobados por el Cuidado de Animales y los Comités de Uso de la Universidad Johns Hopkins.

Con la configuración descrita en este protocolo, los estímulos de olor en la superficie del epitelio olfativo serán compatibles entre preparaciones de tejidos, que permite la comparación entre el tipo salvaje y ratones mutantes, a pesar de que la concentración de olor y la dinámica exacta se desconoce. Varios factores, especialmente la ubicación de la grabación y la velocidad de flujo de aire húmedo, causan variaciones en la EOG. Se debe tener cuidado para grabar desde posiciones similares en el mismo para minimizar la variación de los cornetes. Esto se puede conseguir fácilmente de forma constante la grabación desde el mismo lado de la cabeza y mantener la huella del microscopio, tubo de olor, y micromanipuladores en la mesa de aire sin cambios entre las muestras de tejido. Además, muestras de tejidos deben ser puestos inmediatamente en el flujo de aire húmedo después de la disección para evitar la desecación excesiva de los tejidos. Grabaciones de EOG en ratones también pueden llevarse a cabo con un aparato de perfusión de líquido al pasar el ratón preparado cornetes 7, 14, 15, o dejando la cabeza intacta e insertar el electrodo en un pequeño agujero por encima de los 16 cornetes, 17. Cada variación de grabación EOG tiene sus propias fortalezas: la fase de aire grabaciones en preparaciones de tejidos como se describe en este protocolo requiere una cantidad mínima de instalación y son los más fáciles de llevar a cabo, las grabaciones con un aparato de perfusión líquido facilitar el uso de reactivos farmacológicos, aunque la naturaleza hidrofóbica de sustancias odoríferas muchos complica la entrega de olor, por último, las grabaciones en las que se deja intacta la cabeza se pueden utilizar en &quot;artificial olfatear&quot; los experimentos, a pesar de la colocación del electrodo es más difícil que cuando los cornetes están totalmente expuestos.

<table><tbody><tr><td>Air delivery tube</td><td>equipment</td><td>Custom Made</td><td></td><td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td></tr><tr><td>Air table</td><td>equipment</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>equipment</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>Computer and Data Acquisition Software</td><td>equipment</td><td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td><td></td><td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td></tr><tr><td>Butane torch</td><td>equipment</td><td></td><td></td><td>A cr&amp;#232;me br&amp;#251;l&amp;#232;e torch works well</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>equipment</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>equipment</td><td>Scienscope</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>equipment</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td><td>equipment</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>equipment</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>equipment</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>equipment</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>equipment</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>equipment</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specimen stage</td><td>equipment</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td></tr><tr><td>18 gage needles</td><td>material</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>2 oz. glass bottles</td><td>material</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>material</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Silicone stoppers size 16D</td><td>material</td><td>Chemware</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>material</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>SylGuard 184</td><td>material</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>From World Precision Instruments</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Amyl acetate</td><td>reagent</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Heptaldehyde</td><td>reagent</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>reagent</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>flowmeter</td><td>equipment</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

Los animales dependen del olfato para muchos comportamientos críticos, como la búsqueda de fuentes de alimento, evitar a los depredadores, y la identificación de su misma especie para aparearse y otras interacciones sociales. El electroolfactogram (EOG) de grabación es un método informativo, fácil de realizar, y confiable de la función olfatoria de ensayo a nivel del epitelio olfativo. Desde la descripción de 1956 de la EOG por Ottoson en las ranas 1, el registro EOG se ha aplicado en muchos vertebrados como las salamandras, conejos, ratas, ratones y seres humanos (revisado por Scott y Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Los recientes avances en la modificación genética en ratones han reavivado el interés en la grabación de la EOG para la caracterización fisiológica de la función olfatoria en el knock-out y knock-en ratones. EOG grabaciones se han aplicado con éxito para demostrar el papel central de los componentes de transducción de señales olfativas 3-8, y más recientemente para caracterizar la contribución de ciertos mecanismos de regulación de las respuestas OSN 09.12. Detección de olor se produce en la superficie del epitelio olfatorio en los cilios de la OSN, donde una cascada de transducción de señales conduce a la apertura de los canales iónicos, lo que genera una corriente que fluye hacia los cilios y despolarización de la membrana 13. La EOG es el potencial negativo registrado extracelularmente en la superficie del epitelio olfativo a la estimulación de olor, como resultado de la suma de los posibles cambios causados ​​por cada OSN de respuesta en el campo de la grabación 2. La comparación de la amplitud y la cinética de la EOG así información valiosa sobre la modificación genética y otras manipulaciones experimentales influyen en la señalización moleculares que subyacen a la respuesta a la OSN olor. A continuación se describe una grabación EOG aire en una fase de preparación de los cornetes ratón olfativo. En pocas palabras, tras sacrificar a los ratones, los cornetes olfativas son expuestos por la cabeza que divide a lo largo de la línea media y la eliminación del tabique. La preparación de los cornetes se coloca en la configuración de la grabación, y un electrodo de registro se coloca en la superficie del epitelio olfatorio en uno de los cornetes medial. Un electrodo de referencia está conectado eléctricamente con el tejido a través de una solución tampón. Un flujo continuo de aire húmedo se sopla sobre la superficie del epitelio para mantenerlo húmedo. El vapor de las soluciones de olor se dispersa en el flujo de aire húmedo para estimular el epitelio. Las respuestas son grabadas y digitalizadas para su posterior análisis.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

El electroolfactogram (EOG) de grabación es una manera informativa, fácil de realizar, y fiable para evaluar la función olfatoria a nivel del epitelio olfativo. Este protocolo describe un sistema de grabación, preparación de los tejidos del ratón, la recopilación de datos y análisis de datos básicos.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K vistas.  Johns Hopkins University. El electroolfactogram (EOG) de grabación es una manera informativa, fácil de realizar, y fiable para evaluar la función olfatoria a nivel del epitelio olfativo. Este protocolo describe un sistema de grabación, preparación de los tejidos del ratón, la recopilación de datos y análisis de datos básicos.

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Investigación

Neurociencias

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Las mediciones electrofisiológicas de un sistema olfativo Polilla

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Actividades de imagen de olores provocados en el bulbo olfatorio de ratón utilizando reflexión óptica y señales de autofluorescencia

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts

Recent studies have shown that ocean acidification affects olfactory-driven behavior in fish. This may be due in part to a reduction in olfactory sensitivity in high PCO2/low pH water. To assess the effects of ocean acidification, or olfactory sensitivity in marine fish in general, we propose that extracellular multi-unit recording from the olfactory nerve is the method of choice. Although invasive, it is sensitive, robust, reproducible and independent of external salinity (unlike the electro-olfactogram [EOG], for example). Furthermore, it records a primary sensory input into the CNS, prior to any central processing. We show that this method can show a reduction in olfactory sensitivity that is both temporary and odorant-dependent, using a range of amino acids to construct concentration-response curves and calculate the thresholds of detection.

Extracellular multi-unit recording from the olfactory nerve is a sensitive, robust and reproducible method for assessing olfactory sensitivity in marine fish. It records primary sensory input and is independent of external salinity.

Grabación extracelular multiinsular del nervio olfativo de los teleosts

Recent studies have shown that ocean acidification affects olfactory-driven behavior in fish. This may be due in part to a reduction in olfactory ...

Medio ambiente

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

Registro electrofisiológico de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

Source: Jarriault, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52652">Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates electrophysiological recording of olfactory sensory neurons (OSNs) in mice using a perforated patch-clamp technique. The olfactory epithelium, containing OSNs with fluorophore-tagged odor receptors, is isolated from a mouse and secured in a recording chamber. A recording pipette is clamped to the dendritic knob of an OSN, and nystatin within the pipette perforates the membrane to form electrical connectivity with the cell. Finally, another pipette is used to deliver an odor stimulant, and the electrophysiological activity of the patched cell is recorded.

Registro de neuronas sensoriales olfativas en ratones

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Resumen

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