Wir haben einen schnellen siebentägigen Workflow entwickelt, um zu testen, wie Tumorzellen auf Medikamente reagieren, indem wir Zebrafischembryonen verwenden. Da wir der pädiatrischen Onkologie nahe stehen, haben wir Zugang zu seltenen Krebsproben, und wir begannen mit B-Zell-Vorläufer-Leukämie, aber wir übernehmen das Protokoll jetzt für solide pädiatrische Tumore, um zu sehen, ob der Assay auch in einem klinischen Umfeld funktionieren würde. Wir können erfolgreich von Patienten stammende Leukämiezellen in Zebrafischembryonen züchten, was sie zu einem hervorragenden präklinischen Modell macht.
Die Pharmakokinetik kann jedoch schwierig sein, da einige Medikamente Schwierigkeiten haben, biologische Barrieren zu überwinden, und daher stellen wir sicher, dass wir die Penetration testen, bevor wir mit den Experimenten beginnen. Unser Ansatz ist einzigartig, weil er die Differenzierung der angeborenen Immunzellen blockiert, was den Transplantatzellen der Leukämie hilft, besser zu überleben. Darüber hinaus verwenden wir die Durchflusszytometrie, um die Lebensfähigkeit und Proliferation einzelner Zellen in Transplantatzellen in Pools von 10 Wirtsfischen zu messen.
Dies ermöglicht uns sehr genaue Daten zum Ansprechen auf das Medikament und eine große statistische Aussagekraft. Lösen Sie zunächst 1%Agarose in 100 Millilitern E3-Medium in der Mikrowelle auf. Für die Transplantationsplatte gießen Sie etwa 20 Milliliter des Mediums in eine 10 Zentimeter große Petrischale und füllen sie zur Hälfte.
Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Flüssigkeit gleichmäßig zu verteilen. Für Morpholino-Injektionsplatten stellen Sie die Spritzgussform in zwei Petrischalen auf die flüssige Agarose, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Blasen bilden. Kippen Sie die Deckel, um das Geschirr abzudecken, und lassen Sie es bei Raumtemperatur, bis die Agarose fest wird.
Sobald die Agarose fest geworden ist, lagern Sie die Platten kopfüber bei vier Grad Celsius in einer verschlossenen Plastiktüte. Generieren Sie anschließend die Nadeln aus 10 Zentimeter großen Kapillaren mit einem Nadelabzieher. Brechen Sie die Spitzen der Nadeln ab, um einen geschätzten Durchmesser von 10 Mikrometern zu erreichen.
Um die Morpholinos zu injizieren, werden Chargen von 100 befruchteten Zebrafischeiern mit minimaler Flüssigkeit in die zuvor vorbereitete Injektionsplatte überführt. Richten Sie die Embryonen vorsichtig in den Rillen der Platte aus. Injizieren Sie während des Ein-Zell-Stadiums einen Nanoliter einer 50-mikromolaren Mischung aus spi1- und csf3r-Morpholinos in die Zelle oder den Dottersack direkt unter der Zelle.
Inkubieren Sie die injizierten Eier über Nacht bei 28 Grad Celsius. Entfernen Sie am dritten Tag zur Einleitung der Dechorionation mit einer Pasteur-Pipette alle toten Embryonen, die keinen Herzschlag oder Bewegung zeigen, undurchsichtig erscheinen oder unregelmäßige Formen aus der Schale haben. Drücken Sie das Chorion mit zwei Präzisionszangen zusammen, um es an Ort und Stelle zu halten.
Kneifen Sie in der Nähe der Spitze der Pinzette, während Sie den Embryo mit einer zweiten Pinzette sichern. Ziehe das Chorion vorsichtig auseinander, um den Embryo freizugeben. Inkubieren Sie dechorionierte Embryonen über Nacht bei 28 Grad Celsius.
Bereiten Sie zu Beginn zwei 10 Zentimeter große Petrischalen vor, die mit E3-Medium gefüllt sind, das mit Penicillin, Streptomycin oder E3/P/S ergänzt wird. Stellen Sie die Schalen 30 Minuten lang bei 28 Grad Celsius zum Vorwärmen. Nach der Fluoreszenzzellmarkierung mit CellTrace Violet (CTV) zentrifugieren Sie die BCP-ALL-Zellen.
Fügen Sie dann PBS hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen, und halten Sie es auf Eis. Laden Sie vier Mikroliter Zellsuspension mit einer Microloader-Spitze in die Transplantationsnadel. Geben Sie Tricain in eine Petrischale mit E3/P/S-Medium und Fischembryonen, um eine Endkonzentration von vier Gramm pro Liter zu erreichen, um die Embryonen mindestens zwei Minuten vor der Injektion zu betäuben.
Übertragen Sie anschließend 15 bis 20 dechorionierte Embryonen auf eine mit Agarose beschichtete Injektionsschale und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, um ein Verrutschen der Embryonen zu verhindern. Ordnen Sie die Embryonen auf der Injektionsschale an. Wenn Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel aus dorsokaudaler Richtung einführen, injizieren Sie etwa 1.000 CTV-positive BCP-ALL-Zellen in die Perikardhöhle.
Sobald die 15 bis 20 Embryonen injiziert sind, übertragen Sie sie in die vorgewärmte Petrischale, die mit E3/P/S-Medium gefüllt ist. Inkubieren Sie sowohl die transplantierten Embryonen als auch die nicht transplantierten Kontrollen ein bis drei Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Embryonen unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop, um die erfolgreiche Transplantation zu bestätigen und sicherzustellen, dass das Eigelb intakt ist.
Geben Sie 100 Mikroliter E3/P/S-Medium und 0,5 % DMSO in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Nehmen Sie mit einer Pasteur-Glaspipette den transplantierten Embryo mit so wenig E3-Medium wie möglich auf. Kippen Sie die Pipette, damit der Embryo auf den Boden der Pipettenspitze sinken kann, und geben Sie ihn mit Kapillarkräften in die Vertiefung ab.
Füllen Sie 24 Vertiefungen der 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern entweder der Fahrzeugsteuerungslösung oder zweifach konzentrierten Venetoclax-Lösungen. Halten Sie die Embryonen 72 Stunden lang bei 35 Grad Celsius, einschließlich der nicht transplantierten Embryonen als Kontrollen. Nehmen Sie am Ende des dritten Tages die 96-Well-Platte mit den transplantierten Zebrafischembryonen aus dem Inkubator.
Untersuchen Sie die Platte mit Stereomikroskopie, um gesunde Zebrafischembryonen zu identifizieren und auszuwählen. Poolen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 Wirtsembryonen aus jeder Bedingung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, was im Idealfall zwei Röhrchen pro Bedingung ergibt. Entnehmen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus jedem Röhrchen.
Geben Sie 500 Mikroliter calcium- und magnesiumfreies HBSS in jedes Röhrchen. Dissoziieren Sie die Embryonen und Transplantatzellen mechanisch durch Verreibung mit einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze, wobei Sie etwa 15 Mal auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 350 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Gewebefragmente zu pelletieren.
Bereiten Sie FACS-Röhrchen mit einer 35-Mikrometer-Feinmaschfiltersiebkappe vor, die zwei Milliliter PBS pro Bedingung enthält. Dann das Pellet in 500 Mikroliter Enzymmischung resuspendieren und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Pipettieren Sie die Mischung während der Inkubation alle fünf Minuten auf und ab, wobei Sie für jedes Röhrchen dieselbe Pipettenspitze verwenden, um Gewebeverlust zu vermeiden.
Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in die 35 Mikrometer feinmaschige Filtersiebkappe der FACS-Röhrchen. Das Röhrchen bei 350 g fünf Minuten lang zentrifugieren. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durch, um die Gesamtzahl der Transplantatzellen zu bewerten.
Starten Sie die Datenanalyse mit den CTV- und CD19-gefärbten 3dpi-Kulturzellen. Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit CD19 und CTV, um sicherzustellen, dass sich das Signal überlappt, und um das Vorhandensein der doppelt gefärbten Krebszellen zu bestätigen. Erstellen Sie als Nächstes ein Punktdiagramm mit FSC-A und SSC-A, um intakte Zellen von Ablagerungen zu unterscheiden.
Verwenden Sie dann die intakte Zellpopulation, um ein neues Diagramm mit SSC-A und SSC-H zu erstellen, um einzelne Zellen zu identifizieren. Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit 7AAD und Annexin V unter Verwendung der Einzelzellpopulation, um Zellen in vier Populationen zu unterscheiden. Öffnen Sie die Datei eines transplantierten Zebrafisches.
Trennen Sie menschliche Transplantatzellen von Wirtszellen mithilfe eines Punktdiagramms mit CTV und CD19. Identifizieren und isolieren Sie doppelt positive CTV- und CD19-Transplantatzellen. Kopieren Sie die gleiche Gating-Strategie, die für 3dpi-Kulturzellen beschrieben wurde, und wenden Sie sie auf die Transplantatzellpopulation an.
Führen Sie alle negativen Zellpopulationen von Annexin V und 7AAD in einem Histogramm mit CTV-Werten auf der x-Achse zusammen. Berechnen Sie das geometrische Mittel für alle fünf Proben, um die Proliferationsraten zu bestimmen. Durchflusszytometrische Daten zeigten, dass frische BCP-ALL-Einzelzellen, die in Zebrafischembryonen transplantiert wurden, nach drei Tagen eine Lebensfähigkeit von 95,2 % aufwiesen, 1,5-mal höher als die 61,9 % Lebensfähigkeit von schalenkultivierten Zellen.
Die CTV-Fluoreszenzintensität nahm sowohl unter in vivo- als auch unter in vitro-Bedingungen über drei Tage in ähnlicher Weise ab, was auf vergleichbare Zellteilungsraten hinweist. Intakte Transplantatzellen pro Embryo nach drei Tagen wurden in jedem Pool quantifiziert, was auf eine konsistente Transplantation hinweist.
