Dieses Protokoll zielt darauf ab, interstitielle extrazelluläre Vesikel der Skelettmuskulatur in Muskelgeweben von Nagetieren zu isolieren und zu reinigen. Dieses extrazelluläre Vesikel wird unschätzbare Einblicke in den Muskelstatus und den Krankheitsmechanismus des Menschen mit potenziellen Anwendungen als diagnostische Biomarker und therapeutische Vehikel liefern. Dieses standardisierte Protokoll wird die Analyse und den Vergleich der Eigenschaften von EV aus Skelettmuskeln über verschiedene Muskelproben hinweg ermöglichen, einschließlich der Ausbeute, der Größe, der Ladungszusammensetzung und der Funktion.
Diese Ergebnisse werden unser Verständnis ihrer Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen verbessern und auch die Anwendung dieser EVs als diagnostische Biomarker erleichtern. Unser Labor wird sich auf die zuverlässige Herstellung von hochreinen und ertragreichen interstitiellen extrazellulären Vesikeln für die Skelettmuskulatur auf effiziente und zeitsparende Weise konzentrieren. Unser Ziel ist es, ihre pathologische Rolle und ihr therapeutisches Potenzial zu erforschen, insbesondere im Zusammenhang mit neuromuskulären Erkrankungen.
Befestigen Sie zunächst das euthanasierte Mausbein in einer sterilen Platte, wobei die vordere Seite des Beins nach oben zeigt. Machen Sie mit einer Präparierschere einen kleinen Schnitt von fünf Millimetern in die Haut an der lateralen Seite des Mausknöchels. Führen Sie eine Klinge der Schere in den Schnitt ein und positionieren Sie sie unter der Haut, aber über dem Muskelgewebe.
Schneiden Sie dann die Haut nach oben in Richtung Knie, um den Schnitt zu verlängern. Greife mit einer rauen Pinzette die Haut entlang des Schnitts und ziehe sie zurück, um die Öffnung zu erweitern, bis der Muskel sichtbar wird. Lokalisieren Sie nun den Musculus tibialis anterior oder TA, der vom Knie bis zum Knöchel verläuft, entlang der lateralen Seite des Tibiaknochens.
Verwenden Sie eine geschärfte Pinzette, um das Bindegewebe, das den TA-Muskel bedeckt, zu greifen und vorsichtig abzuziehen. In der Nähe des Knöchels identifizierst du die TA-Sehne, die mit dem TA-Muskel verbunden ist, und die kleinere EDL-Sehne, die sich neben der TA-Sehne auf der lateralen Seite befindet. Verwenden Sie eine Präparierschere, um beide Sehnen zu durchtrennen.
Verwende eine Pinzette mit rauem Ende, um beide Sehnen zu greifen. Trennen Sie mit einer weiteren Pinzette vorsichtig die Sehnen und isolieren Sie den TA vom EDL. Hebe dann den TA-Muskel mit einer rauen Pinzette an der frisch durchtrennten Sehne an.
Verwende eine Präparierschere, um die TA-Sehne in der Nähe des Knies zu durchtrennen und den Muskel zu entfernen. Lassen Sie nun das Bein los und drehen Sie die Maus so, dass die hintere Seite des Beins nach oben zeigt. Wenn ein Teil der Haut bereits entfernt wurde, schneiden Sie die verbleibende Haut in der Nähe des Knöchels mit einer Präparierschere ab.
Fassen Sie die geschnittene Haut mit einer rauen Pinzette und schälen Sie sie nach oben in Richtung Kniekehle, wobei der Gastrocnemius-Muskel freigelegt wird. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Gastrocnemius-Sehne in der Nähe des Knöchels zu durchtrennen. Fassen Sie die Gastrocnemius-Sehne mit einer rauen Pinzette und heben Sie sie nach oben, um die Unterseite des Gastrocnemius-Muskels freizulegen.
Lokalisieren Sie dann die kleinere Soleussehne unterhalb des Gastrocnemius, in der Nähe des Knies, wo der Gastrocnemius noch verbunden ist. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Soleussehne zu durchtrennen, so dass sich der Soleus-Muskel nach oben zusammenziehen kann. Fassen Sie die durchtrennte Soleussehne mit einer scharfen Pinzette und heben Sie sie vorsichtig an, um den Soleus-Muskel von der Unterseite des Gastrocnemius zu lösen.
Verwenden Sie eine Präparierschere, um das Ende des Soleus zu durchtrennen, wo er mit dem abgetrennten Ende des Gastrocnemius ansetzt und die beiden Muskeln vollständig trennt. Schneiden Sie mit einer Präparierschere das Ende des Gastrocnemius in der Nähe des Knies ab und legen Sie es in PBS auf Eis. Nachdem Sie die vier Muskeln unterhalb des Knies entfernt haben, drehen Sie die Maus so, dass die vordere Seite nach oben zeigt.
Positionieren Sie das Mausbein in einem 90-Grad-Winkel, um den Quadrizepsmuskel zur Beugung zu zwingen. Verwende eine Präparierschere, um die Sehne zu durchtrennen, die dem Knie am nächsten liegt. Um dann den Quadrizeps vom Oberschenkelknochen zu trennen, schneiden Sie zwischen Muskel und Knochen, bis nur noch die proximale Sehne befestigt bleibt.
Durchtrennen Sie die proximale Sehne mit einer Präparierschere und entfernen Sie den Quadrizeps. Spülen Sie alle entfernten Muskeln mehrmals mit PBS aus, um Verunreinigungen wie Fell und Blut zu entfernen. Trocknen Sie die Muskeln vorsichtig mit Küchenpapier ab.
Beginnen Sie damit, die Sehnen vorsichtig mit einer scharfen Pinzette, einer Splitterpinzette, einem Skalpell oder einer Schere aus der Muskelprobe zu entfernen. Schneiden Sie dann mit einer Schere oder einem Skalpell den Muskel längs entlang der Muskelfasern von einer Sehne zur anderen in einen Millimeter dicke Stücke. Zur Herstellung eines Verdauungsenzympuffers mischen Sie zwei Milligramm Kollagenase und zwei Enzyme pro Milliliter DMEM mit 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung.
Nach dem Mischen die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter filtrieren. Trennen Sie das Muskelgewebe in Aliquots, die jeweils 20 Milligramm Muskeln enthalten. Für die enzymatische Dissoziation wird ein Milliliter des vorbereiteten Puffers zu jedem Aliquot hinzugefügt und inkubiert.
Bereiten Sie neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und etikettieren Sie sie. Richten Sie einen 0,45-Mikrometer-Filter ein, indem Sie den Kolben von einer Fünf-Milliliter-Spritze entfernen. Schrauben Sie die Spritzennabe in das obere Ende des 0,45-Mikrometer-Filters und positionieren Sie das untere Ende des Filters in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen.
Dann zentrifugieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 1000 g und vier Grad Celsius, um Rückstände zu pelletieren. Verwenden Sie eine P-200-Mikropipette, um den Überstand in die Spritze zu übertragen. Nachdem Sie den Kolben wieder in die Spritze eingesetzt haben, schieben Sie den Überstand langsam durch den Filter, damit er sich in dem beschrifteten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen sammeln kann.
Entfernen Sie den Spritzenkolben wieder. Geben Sie mit einer P-200-Mikropipette etwa 200 Mikroliter PBS in die Spritze. Setzen Sie den Kolben wieder ein und drücken Sie die 200 Mikroliter PBS langsam durch den Filter, um den verbleibenden Überstand in das beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen zu spülen.
Füllen Sie die gefilterte Lösung in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen um, die für Geschwindigkeiten bis zu 200.000 G geeignet sind. Nachdem Sie die Röhrchen verschlossen haben, legen Sie sie in den Rotor der Mikro-Ultrazentrifuge, um sicherzustellen, dass sie ausbalanciert sind. Schalten Sie die Mikro-Ultrazentrifuge ein und stellen Sie sie auf einen einstündigen Betrieb bei 100.000 G und vier Grad Celsius ein. Platzieren Sie den beladenen Rotor mit den Röhrchen in der Mikro-Ultrazentrifuge.
Schließen Sie den Deckel und schalten Sie das Vakuum ein, um den Vorgang zu starten. Sobald das Vakuum die zweite Stufe erreicht hat, drücken Sie die Starttaste und warten Sie, bis der Zentrifugationsprozess abgeschlossen ist. Nachdem der Zentrifugationszyklus abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Vakuum-Taste, um die Kammer wieder unter Druck zu setzen, bevor Sie den Rotor und die Röhrchen entfernen.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P-200-Mikropipette aus jedem Röhrchen. Verwenden Sie dann dieselbe P-200-Mikropipette, um 50 Mikroliter PBS in jedes Röhrchen zu geben.
