Wir arbeiten zwischen den Fachbereichen Chemie und Lebenswissenschaften und entwickeln neuartige unterstützende reaktive kovalente Liganden für eine Reihe von Angriffszielen gegen Krebsmedikamente. Es ist zu hoffen, dass diese Moleküle in Zukunft verwendet werden, entweder als Therapeutika oder möglicherweise als chemische Sonden. Daher gibt es mehrere Technologien für das Screening kovalenter Liganden.
Diese können grob unterteilt werden in proteomische Techniken, bei denen Verbindungen mit kultivierten Zellen inkubiert werden, und Massenspektrometrie, die verwendet wird, um zu bestimmen, welche Proteine die Moleküle markieren, und zielbasierte Methoden, bei denen Bibliotheken von Elektrophilen mit einzelnen Proteinen inkubiert werden. Eine wesentliche experimentelle Herausforderung betrifft die Reaktivität kovalenter Liganden. Übermäßig reaktive Moleküle erscheinen während des Screenings oft als Treffer, sind aber ungeeignet, da sie viele verschiedene Proteine in der Zelle unselektiv markieren.
Die Wirkstoffverbindung ist daher von entscheidender Bedeutung, die bei jedem Schritt der kovalenten Wirkstoffforschung berücksichtigt werden muss. Daher haben die Gruppen von Mann und Armstrong am Imperial College eine neue Methode entwickelt, um Elektrophile gegen ein Proteinziel zu screenen, das sogenannte quantitative irreversible Tethering oder der qIT-Assay. Unser Protokoll bietet eine dringend benötigte, neue Methode zum Screening von Elektrophilen gegen ein Proteinziel, die skalierbar ist, keine Massenspektrometrie erfordert und die intrinsische Reaktivität der Verbindung kontrolliert.
Bereiten Sie zunächst alle erforderlichen Stammlösungen vor und lassen Sie sie vor dem Experiment zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Entgasen Sie einen quantitativen, irreversiblen Tethering- oder qIT-Assay-Puffer mit Argongas für ca. 30 Minuten. Für einen leistungsstarken Pufferaustausch verdünnen Sie die Proteinlösung über den entgasten qIT-Assay-Puffer hinaus in einer Spin-Filtereinheit und schleudern Sie sie 15 Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius, um das Protein zu konzentrieren.
Verdünnen Sie dann die Zielproteinlösung auf eine Konzentration von 15 Mikromolaren in entgastem qIT-Assay-Puffer, um neun Milliliter der Lösung herzustellen. Dispensieren Sie die TCEP-Agraose-Lösung, den qIT-Puffer und den Glutathion-Stamm in die entsprechenden Vertiefungen der 384-Well-Platten. Übertragen Sie 1,8 Mikroliter aus jeder entsprechenden Vertiefung der Fragmentbibliotheksplatte, um eine Verdünnungsplatte für Verbindungen zu erstellen, die jede Verbindung auf 1,5 Millimolar in qIT-Assay-Puffer plus 3 % DMSO verdünnt.
Verwenden Sie eine Pipettierstation 384, um 20 Mikroliter Verbundlösung aus jeder Vertiefung der Verdünnungsplatte in beide Reaktionsplatten zu übertragen. Richten Sie zunächst den quantitativen irreversiblen Tethering- oder qIT-Assay mit dem gewünschten Protein und Glutathion ein. Geben Sie 500 mikromolare CPM-Aktien in 111,2 Mikroliter-Aliquote in Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius.
Nach dem Auftauen des CPM-Stoffes fügen Sie ihn zu 40 Millilitern qIT-Assay-Quench-Puffer hinzu, um eine 1,4-mikromolare Lösung herzustellen. Geben Sie 27 Mikroliter CPM-Quench-Lösung in jede Vertiefung von zwei frischen 384-Well-Platten. Die Proteinreaktionsplatte wird drei Minuten lang bei 200 g zentrifugiert, um TCEP-Agarose zu pelletieren. Verwenden Sie zu festgelegten Zeitpunkten eine Pipettierstation 384, um drei Mikroliter Probe aus jeder Vertiefung der Proteinreaktionsplatte auf die CPM-Quenchplatte zu übertragen.
Entnehmen Sie die Probe von der Oberseite der Vertiefung und vermeiden Sie das Ansaugen von TCEP-Agarose an der Unterseite. Inkubieren Sie die CPM-Quenchplatten eine Stunde lang bei Raumtemperatur und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit einer Anregung bei 384 Nanometern und einer Emission bei 470 Nanometern. Führen Sie zunächst ein quantitativ-irreversibles Tethering oder den qIT-Assay mit dem gewünschten Protein durch und schrecken Sie die Proben in der CPM-Platte ab.
Berechnen Sie für jede Quench Z prime als Maß für die Assay-Qualität. Berechnen Sie dann die mittleren Fluoreszenzwerte für die negativen Kontrollvertiefungen in den Spalten eins und zwei und die positiven Kontrollvertiefungen in den Spalten 23 und 24. Normalisieren Sie jede Reaktion gut auf die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte der Positiv- und Negativkontrolle und stellen Sie den über die Zeit veränderten Prozentsatz für jede Verbindung, die mit Glutathion und mit dem Zielprotein reagiert, separat dar.
Passen Sie mit GraphPad die normalisierten prozentual modifizierten Daten über die Zeit an ein einphasiges exponentielles Zerfallsmodell für beide Reaktionen unter Verwendung der Gleichung AE hoch KT C an. Verwenden Sie die Rate, mit der Fragmente mit Protein und Glutathion reagieren, um den Geschwindigkeitsverstärkungsfaktor oder REF-Wert für jedes Fragment zu berechnen. Um schließlich Trefferfragmente auszuwählen, legen Sie einen REF-Schwellenwert oder eine beliebige Trefferrate fest, oder wählen Sie Fragmente mit REF aus, die drei Standardabweichungen größer als das geometrische Mittel sind. Verbindung eins reagierte mit dem Cysteinrest auf dem Zielprotein mit einer sechsfach höheren Rate als mit Glutathion und erfüllte das Hit-Kriterium von REF größer als drei.
Verbindung zwei zeigte im Vergleich zu Glutathion keine beschleunigte Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Ziel-Cysteinrest, was auf einen Mangel an produktiven nicht-kovalenten Wechselwirkungen hinweist und daher nicht als Treffer ausgewählt wurde.
