Dieses Protokoll ermöglichte den kontinuierlichen Nachweis eines vorübergehenden Effekts in Form einiger morphologischer Veränderungen während einer Virusinfektion, wie z. B. Ablösung und Schweben von adhärenten Zellen. Dieses Protokoll ermöglichte einen nicht-invasiven und arbeitsintensiven Ansatz zur kontinuierlichen Überwachung zellulärer morphologischer Veränderungen und zur Erfassung vorübergehender Effekte wie Gefäßleckagen, die durch den Endpunkt-Assay übersehen werden könnten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Veränderungen der vaskulären Integrität anderer Zelllinien in verschiedenen Versuchsanordnungen zu analysieren, wenn es sich bei den Zellen um adhärente Zellen handelt.
Nachdem Sie die HUVECs vorbereitet haben, starten Sie die RTCA-Softwareanwendung mit einem Doppelklick auf das Symbol auf dem Desktop. Geben Sie den Benutzernamen und das Passwort in das Anmeldefenster ein. Platzieren Sie eine 96-Well-RTCA-Widerstandsplatte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator.
Wechseln Sie dann zur Registerkarte "Experimentnotizen" der RTCA-Software, und geben Sie den Namen des Experiments, die Seriennummer des Geräts und den Gerätetyp ein. Markieren Sie auf der Registerkarte "Layout" unter der Registerkarte "Zelle" der RTCA-Software alle Wells und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierten Wells, um sicherzustellen, dass alle Wells aktiviert sind. Öffnen Sie als Nächstes die Registerkarte "Zeitplan" der RTCA-Software.
Klicken Sie auf Step_1, und legen Sie die Sweeps auf 10 und das Intervall auf 30 Sekunden fest. Klicken Sie dann in der oberen linken Ecke der Software auf "Starten", um den Überprüfungslauf zu starten. Öffnen Sie nach der Ausführung die Registerkarte Zellenindex, um die Daten zu überprüfen.
Alle Zellindexwerte sollten kleiner als 0,063 sein. Überprüfen Sie dann die Scan-Rohdaten im unteren Teil der Registerkarte "Zellenindex" auf sich wiederholende Wertemuster, wie im Manuskript beschrieben. Um den Überprüfungslauf abzuschließen, klicken Sie auf Platte, und wählen Sie Trennplatte aus.
Entferne die 96-Well-RTCA-Widerstandsplatte von der RTCA-Station. Um Hintergrundinformationen zu RTCA zu erhalten, waschen Sie die mit Kollagen Typ eins beschichtete spezielle Gold-Mikroelektrodenplatte zweimal mit 60 Mikrolitern HBSS pro Well. Verwerfen Sie das verbleibende HBSS und fügen Sie 50 Milliliter extrazelluläre Matrix pro Vertiefung hinzu.
Legen Sie dann die Platte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator. Geben Sie auf der Registerkarte "Erfahrungsnotizen" der RTCA-Software den Namen des Experiments, die Seriennummer des Geräts und den Gerätetyp ein. Navigieren Sie zur Registerkarte "Zelle" der RTCA-Software und wählen Sie die Registerkarte "Layout" aus.
Markieren Sie die Wells, die verwendet werden sollen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierten Wells, um sicherzustellen, dass alle Wells aktiviert sind. Gehen Sie nun auf die Registerkarte "Zeitplan" der RTCA-Software. Klicken Sie auf Step_1 und klicken Sie in der oberen linken Ecke auf Start oder Fortfahren, um eine Hintergrundlesung zu erhalten.
Die Platte ist nun bereit für die Zellaussaat und die Entnahme aus der RTCA-Station. Danach werden 10 bis die vierten Zellen pro Vertiefung von HUVECs in die Gold-Mikroelektrodenplatte mit 50 Mikrolitern pro Vertiefung des konditionierten Mediums eingesät. Legen Sie die Platte zurück in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator, wobei die A1-Vertiefung nach innen zeigt.
Klicken Sie dann auf der Registerkarte "Zeitplan" der Software in der oberen linken Ecke auf "Schritt hinzufügen". Klicken Sie auf Step_2. Ändern Sie die Sweeps in 601, das Intervall in zwei Minuten, und klicken Sie auf Anwenden.
Klicken Sie auf Step_2 und klicken Sie in der oberen linken Ecke der Software auf Start oder Weiter. Nach 20 Stunden Inkubation, wenn die Zellindexwerte auf der Registerkarte "Well-Diagramm" ein Plateau zeigen, ist die Platte bereit für die Infektion. Klicken Sie auf der Registerkarte "Zeitplan" der RTCA-Software auf Schritt abbrechen.
Die Platte kann nun von der RTCA-Station entfernt werden. Um die HUVECs zu infizieren, holen Sie den Zika-Virusvorrat aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Verdünnen Sie den Zika-Virus-Stamm mit serumfreier extrazellulärer Matrix in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um eine Vielzahl von Infektionen von 0,1 und eins zu erreichen.
Als Nächstes entsorgen Sie das konditionierte Medium aus jeder Vertiefung und spülen Sie jede Vertiefung mit 60 Mikrolitern HBSS, während Sie die Seite der Vertiefung verwenden. Geben Sie 40 Mikroliter verdünnte Virusprobe in die Vertiefung, beginnend mit der höchsten bis zur niedrigsten Verdünnung, indem Sie die Seite der Vertiefung verwenden. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um die Virusabsorption zu ermöglichen.
Schwenken Sie die Platte fünfmal alle 15 Minuten, um die Virusabsorption in der gesamten Zellmonoschicht zu ermöglichen. Nach einer Stunde Inkubation wird die Virussuspension von der niedrigsten zur höchsten Konzentration entfernt und verworfen. Waschen Sie die infizierten Zellen zweimal mit 60 Millilitern HBSS.
Überlagern Sie die Vertiefungen mit extrazellulärer Matrix, die mit 2 % FBS ergänzt ist. Für die Positivkontrollvertiefungen wird das Thrombin in 20 Einheiten pro Milliliter mit extrazellulärer Matrix, ergänzt mit 2 % FBS, verdünnt und die Vertiefungen mit thrombinhaltigem extrazellulärem Matrixmedium an der Seite der Vertiefung überlagert. Klicken Sie nun auf die Registerkarte "Zeitplan" und fügen Sie einen Schritt in der oberen linken Ecke hinzu.
Navigieren Sie zu Step_3, und ändern Sie die Sweeps in 3, 601 und das Intervall in zwei Minuten. Klicken Sie auf "Übernehmen" und dann im Popup-Fenster auf "OK". Legen Sie die infizierte spezialisierte Gold-Mikroelektrodenplatte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Kulturinkubator.
Klicken Sie abschließend auf Step_3 und klicken Sie in der oberen linken Ecke der Software auf Weiter starten. Der Zellindexwert von HUVECs, die mit dem Zika-Virus P6-740 infiziert waren, begann 15 Stunden nach der Infektion im Vergleich zur negativen Infektionskontrolle zu sinken. Die HUVECs, die mit einer höheren Dosis des Zika-Virus P6-740 infiziert waren, zeigten 11 Stunden nach der Infektion einen Abfall des Zellindex.
24 Stunden nach der Infektion gab es einen Rückgang des normalisierten Zellindexwerts um 5 % bzw. 7 %, wenn die Endothelzellen mit einer Infektionsmultiplizität von 0,1 bzw. eins infiziert wurden. Eine 50%ige Reduktion des normalisierten Zellindexwertes wurde 96 Stunden nach der Infektion und 66,75 Stunden nach der Infektion bei einer Infektionsmultiplizität von 0,1 bzw. eins festgestellt. Der normalisierte Zellindexwert erreichte seinen niedrigsten Punkt 107 Stunden nach der Infektion, mit einer Reduktion von 51 % und 60 % bei einer Infektionsmultiplizität von 0,1 bzw. eins.
Es wurde festgestellt, dass der normalisierte Zellindexwert von 107 Stunden nach der Infektion bis zum Ende des Experiments 168 Stunden nach der Infektion um 4 % und 13 % anstieg. Vor jedem RTCA-Experiment ist ein Widerstandsverifizierungslauf mit der 96-Well-RTCA-Platte unerlässlich, um sicherzustellen, dass jeder Biosensor gut funktioniert, um zuverlässige Zellindexwerte zu erzeugen.
