Diese Methode bietet eine Möglichkeit, das Signal von Bindungsereignissen in eine Form zu bringen, die bei geringem Ressourcenverbrauch visuell erkennbar ist oder mit absorptionsbasierter Instrumentierung quantifiziert werden kann. Dies ist ein relativ schnelles Ein-Topf-Protokoll, um das Vorhandensein des Aptamer-Ziels in einer Probe von Interesse zu bestimmen. Die Ergebnisse können mit einer Standard-Kalibrierkurve verglichen werden, wenn eine Quantifizierung gewünscht wird.
Der Einzelne muss beim Übertragen und Mischen der Lösungen sehr genau vorgehen, da ein unzureichendes Mischen zu negativen Ergebnissen führt. Stellen Sie außerdem sicher, dass Reagenzien und Lösungen bis zur Verwendung gekühlt aufbewahrt werden, um das Hintergrundsignal zu minimieren. Beginnen Sie mit der Aktivierung der Ribozym-Spaltprodukte, indem Sie fünf Einheiten der T4-Polynukleotidkinase in ein PCR-Röhrchen geben.
Geben Sie dann einen Mikroliter vorbereiteten 5X-Ribozym-Puffer in jedes Probenröhrchen. Um die Spezifität visuell nachzuweisen, geben Sie 1,5 Mikroliter zweimillimolares Theophyllin oder zwei millimolares Koffein als Testproben in jedes Probenröhrchen und mischen Sie jede Probe gründlich durch fünf- bis 10-maliges Pipettieren. Als nächstes werden zwei Mikroliter 600 nanomolare RNA, die eine zielspezifische aptamere Domäne enthält, in jedes Probenröhrchen gegeben und anschließend pipettiert, um die Komponenten schnell zu mischen.
Legen Sie nun die Röhre auf einen kalten Block, um das Hintergrundsignal zu minimieren. Nachdem Sie alle Reaktionsgefäße vorbereitet haben, inkubieren Sie jede Probe genau drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation legen Sie die Probenröhrchen sofort wieder in Eis ein.
Geben Sie 3,5 Mikroliter Nicase-Polymerase-Enzymmischung in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut. Geben Sie dann 31,5 Mikroliter EXPAR-Reaktionsmischung mit Templatnukleotiden und Reaktionspuffer in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es durch Pipettieren. Sobald alle Proben vorbereitet sind, inkubieren Sie die vorbereitete Probe bei 55 Grad Celsius fünf Minuten lang mit einem Timer.
Setzen Sie die Probenröhrchen nach der Inkubation sofort wieder in das Eis ein. Geben Sie zwei Mikroliter Häminlösung in jedes Probenröhrchen für die Farbentwicklung und mischen Sie es gut. Geben Sie dann 58 Mikroliter der handelsüblichen TMB-Lösung in jedes Probenröhrchen, mischen Sie es gut und inkubieren Sie es für die Farbentwicklung.
Lesen Sie die Proben qualitativ mit dem Auge ab oder quantifizieren Sie die Ergebnisse mit einem Absorptionsplattenleser, wie im Manuskript beschrieben. Das optimierte Konstrukt konnte in 30 Minuten nur 500 nanomolare Theophylline erkennen. Probenpräparate, die dem Target ausgesetzt sind, erzeugen eine blaue Farbe, während Proben, die kein Target enthalten, farblos bleiben.
Aus dem am A450 gemessenen Signal wurde nach 30 Minuten Farbentwicklung eine Standardkurve erstellt. Es ist wichtig, die Proben auf Eis zu halten, wenn keine Inkubationen durchgeführt werden, da selbst die optimierte RNA immer noch eine geringe Hintergrundaktivität aufweist.
