Die Rolle der Mikroglia im Hippocampus ist noch nicht vollständig verstanden. Mit diesem Protokoll kann direkt abgebildet werden, wie Mikroglia mit Neuronen in Kontakt treten und diese regulieren. Die In-vivo-Bildgebung von ruhenden Mikroglia und Neuronen im Hippocampus war bisher sehr schwierig.
Diese Methode kann dieses Problem lösen. Um das Beobachtungsfenster zu implantieren, machen Sie mit einer Hautstanze eine kreisförmige Rille von drei Millimetern auf dem Schädel, um sicherzustellen, dass die Rille mit dem zuvor markierten Bereich ausgerichtet ist. Wenn der Hautstanz die innerste Schicht des Schädels erreicht, bevor er die darunter liegende Dura berührt, heben Sie die zentrale Knocheninsel vorsichtig mit einer 30-Gauge-Nadel an.
Als nächstes entfernen Sie die Dura vorsichtig mit einem Dura-Picker. Saugen Sie die Pia, die Pialgefäße und das kortikale Gewebe von der Oberfläche ab. Halten Sie die Tiefe der freiliegenden Gewebeoberfläche über das gesamte Schädelfenster homogen und vertiefen Sie die Aspiration allmählich, bis Fasern der äußeren Kapsel freigelegt sind.
Nachdem Sie die Saugspitze an der äußeren Kapsel in der Nähe des lateralen Ventrikels am rostrolateralen Ende des Schädelfensters positioniert haben, entfernen Sie die Oberflächenschicht der äußeren Kapsel, die im Caudomedial in rostrolateraler Richtung verläuft. Entfernen Sie dann die innere Schicht, die in mediolateraler Richtung verläuft. Bestätigen Sie die Entfernung der gesamten äußeren Kapsel, indem Sie die vollständige Freilegung der Alveusoberfläche und der dorsalen Hippocampus-Kommissur überprüfen.
Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Blutung vollständig gestoppt ist, füllen Sie das Loch mit steriler Kochsalzlösung bis zur Höhe der Schädeloberfläche. Führen Sie als Nächstes das Metallrohr mit Glasboden senkrecht in das Loch ein, während Sie das überschüssige Wasser, das von den Seiten des Rohrs überläuft, ansaugen, bis der Glasboden leicht gegen die Alveus drückt und das darunter liegende CA1 teilweise abflacht. Befestigen Sie mit dem Zahnharzzement die Wand des eingeführten Schlauchs am umgebenden Schädel.
Setzen Sie die Maus in die Kopfhaltevorrichtung unter die Objektivlinse des Zwei-Photonen-Mikroskops und auf den motorisierten XY-Scantisch. Füllen Sie dann den Raum zwischen dem Glasboden und der Objektivlinse mit Wasser, ohne Luftblasen zu erzeugen. Stellen Sie den Fokus auf CA1 ein, wobei die vom Hirnparenchym emittierte Fluoreszenz und das vom Rand des Metallrohrs reflektierte Licht unter kontinuierlicher Beleuchtung durch den gepulsten Laser geleitet werden.
Stellen Sie den Winkel des Mauskopfes ein, indem Sie die Kopfhaltevorrichtung so neigen, dass der Glasboden parallel zur Bildebene ist. Passen Sie dann den Korrekturkragen des Objektivs an, um die höchste Auflösung in einer Tiefe der Zielstruktur im CA1 zu erreichen. Vergewissern Sie sich als nächstes, dass die fluoreszierenden Zellen in der molekularen Schicht des Gyrus dentatus oder DG in einer Tiefe von 500 Mikrometern vom Glasboden im gesamten Sichtfeld abgebildet werden.
Nur im Falle einer erfolgreichen Operation können die DG-Signale sofort erkannt werden. Die postoperative Maus wird für mehrere Wochen in Einzelhaltung aufgezogen. Legen Sie die betäubte Maus unter das Zwei-Photonen-Mikroskop.
Führen Sie die Bildgebung des Hippocampus durch. Vergewissern Sie sich, ob die Qualität und Intensität der Bilder, die nach der Reduzierung des postoperativen Ödems aufgenommen wurden, besser oder vergleichbar sind mit denen, die am Operationstag aufgenommen wurden. Stellen Sie sicher, dass die Mikroglia ihre verzweigte Morphologie wiedererlangt haben.
Führen Sie dann eine In-vivo-Bildgebung auf der interessierenden Schicht im CA1 durch. Die Mikroglia in CX3CR1-GFP-Mäusen, die unmittelbar nach der Operation eingefangen wurden, zeigten keine auffällige Aktivierung. Nach erfolgreicher Operation ohne Induktion eines Ödems überstiegen die Zwei-Photonen-Bildgebungstiefen die gesamten CA1-Schichten und erreichten 500 Mikrometer von der Operationsoberfläche.
Die Mikroglia zeigten in der chronischen Phase von mehr als drei Wochen nach der Operation eine höhere Fluoreszenzintensität und -auflösung sowie eine homogenere Verteilung aufgrund reduzierter Ödeme und Entzündungen. Mikroglia in allen Schichten stellten bereits ihre verzweigte Morphologie wieder her und zeigten unbewegliche Zellkörper und hochmodale Prozesse. Die hochauflösenden Bilder über den gesamten CA1 wurden über mehrere Monate zur Verfügung gestellt.
Die Signale von fluoreszierenden Mikroglia helfen bei der Identifizierung von Hippocampusschichten. Mikroglia in der Alveus hatten verlängerte Zellkörper und Fortsätze, die sich entlang der axonalen Bahnen erstreckten. Mikroglia im Stratum pyramidale konnten durch die geringere Dichte ihrer Fortsätze unterschieden werden.
Die Grenze zwischen dem CA1 und dem DG konnte durch dicke Blutgefäße entlang der Grenze erkannt werden, was durch die Markierung von Gefäßen mit Sulforhodamin 101 besser erkannt wurde. Als Anwendungsbeispiel wurden GFP-positive Mikroglia und tdTomato-markierte Pyramidenneuronen simultan abgebildet. Neuronale Markierungen halfen, die genauen Schichtstrukturen des CA1 zu verstehen.
Der wichtigste Punkt ist die Reduzierung von Operationsschäden. Vermeiden Sie Gewebeschäden durch Aspiration. Üben Sie beim Einsetzen des Glasbodens sanften Druck aus und vermeiden Sie, dass der Zahnzement die Gehirnoberfläche berührt.
Dieser Ansatz wird dazu beitragen, die Rolle der Mikroglia im Hippocampus zu identifizieren. Zum Beispiel, wie Mikroglia mit Neuronen interagieren, wie sie am Lernen beteiligt sind und wie sie Gehirnerkrankungen kontrollieren.
