Diese Methode widmet sich der Untersuchung der Rolle von Mikrotubuli bei der Invasion von Hirntumoren, indem die atopische Injektion von Hirntumorzellen im Zebrafisch an die subzelluläre intravitale Bildgebung gekoppelt wird. Der Hauptvorteil der Technik liegt in der hohen räumlichen zeitlichen Auflösung, mit der das Mikrotubuli-Zytoskelett erfasst wird. Es ist einzigartig für in vivo Hirntumor-Invasionsmodelle und ermöglicht eine eingehende Analyse der Mikrotubulidynamik.
Die subzelluläre Bildgebung der In-situ-Hirntumorzellinvasion kann für die Analyse jedes Proteins von Interesse verwendet werden, das möglicherweise an der Krebsinvasion beteiligt ist. Um zu beginnen, waschen Sie die bei 37 Grad Celsius kultivierten Glioblastomzellen mit PBS. Lösen Sie die Zellen ab, indem Sie einen Milliliter 0,05% Trypsin EDTA hinzufügen und fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius im Zellinkubator inkubieren, bis alle Zellen vollständig abgelöst sind.
Resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter komplettem Glioblastom-Zellmedium in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 45 Milliliter eiskaltes PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 134 mal G für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit einem Milliliter eiskaltem PBS, indem Sie gründlich auf und ab pipettieren.
Fügen Sie weitere 49 Milliliter eiskaltes PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 134 mal G für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern eiskaltem PBS. Für die Dauer des Transplantationsvorgangs auf Eis lagern.
Um die Glioblastomzellen in das Mittelhirn der Zebrafischlarven zu injizieren, füllen Sie eine Mikroinjektionsgussplatte mit sechs Milliliter E3-Medium, ergänzt mit 160 Milligramm pro Liter Tricain. Ein Dutzend DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED-Larven in die Mikroinjektionsplatte geben. Sobald die Larven betäubt sind und nicht mehr auf Berührung reagieren, richten Sie sie in den Gräben auf ihrer Seite aus, Kopf hoch und der Dottersack mit einem Pinsel der Größe 00 gegen die Wand des Grabens gedrückt.
Laden Sie dann fünf Mikroliter Glioblastomzellen mit Microloading-Spitzen in die Mikrokapillare und führen Sie die Kapillare in den universellen Kapillarhalter ein. Legen Sie die Mikroinjektionsplatte mit den betäubten Larven auf den Stereomikroskoptisch. Legen Sie die Spitze der Mikrokapillare mit den Mikromanipulatorknöpfen auf den Rand der Mikroinjektionsplatte.
Dann brechen Sie es mit einem Skalpell, um einen scharfen Eintrittspunkt zu erzeugen, der ungefähr so groß ist wie der Durchmesser einer Zelle. Überprüfen Sie, ob die Zellen aus der Kapillare fließen, indem Sie vorsichtig Öl in den Mikroinjektor laufen lassen und die Spitze der Nadel in das Medium tauchen. Konzentrieren Sie die Zellen an der Spitze der Kapillare, um die Anzahl der injizierten Zellen pro injiziertem Volumen zu maximieren und das Füllen des Hirngewebes mit PBS zu vermeiden.
Untersuchen Sie sorgfältig die Zellen, die aus der Mikrokapillare kommen, während Öl manuell in den Injektor eingeführt wird. Definieren Sie empirisch die Anzahl der Umdrehungen, die auf dem manuellen Drehknopf benötigt werden, um 20 bis 50 Zellen zu liefern. Wenn die Zellen konzentriert genug sind, reicht typischerweise eine sanfte Drehung aus, um etwa 10 Zellen auszustoßen.
Nähern Sie sich der Spitze der Kapillare gegen das linke optische Tectum knapp über der mittleren Hirnvene. Drücken Sie die Kapillare vorsichtig gegen die Larven, bis die Hautmembran bricht. Sobald eine geeignete Position im optischen Tectum erreicht ist, werfen Sie die Zellen aus.
Beobachten Sie sorgfältig die Spitze der Kapillare, um den Zellstrom im Inneren des Tieres zu visualisieren und so eine erfolgreiche Injektion sicherzustellen. Wiederholen Sie den Vorgang für so viele Tiere wie erforderlich. Je nachdem, wie schnell der Experimentator injiziert, kann aufgrund der schnellen Zellverklumpung in der Kapillare alle 10 bis 20 Larven ein Nadelwechsel erforderlich sein.
Sobald die Xeno-Transplantation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Larve von der Mikroinjektionsplatte und wählen Sie sie in einer 24-Well-Platte aus, die mit Mineralwasser PTU und methylenblauem Medium gefüllt ist. Bereiten Sie eine 1% niedrigschmelzende AH-KROH-Lösung vor. 500 Mikroliter gekochte 1% niedrigschmelzende AH-KROH-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und auf einem Hitzeblock bei 37 Grad Celsius abkühlen lassen.
160 Mikrogramm pro Liter Tricain in den AH-KROHS geben und gut mischen. Ein bis vier xenografierte Larven in eine 3,5 Zentimeter große Petrischale geben, die mit Mineralwasser PTU und Methylenmedium gefüllt ist, ergänzt mit 160 Mikrogramm pro Liter Tricain. Sobald die Larven betäubt sind und nicht mehr auf Berührung reagieren, übertragen Sie sie vorsichtig in das Röhrchen mit AH-KROHS und Tricaine mit einer feinen Transferpipette.
Mischen Sie die Larve vorsichtig mit dem AH-KROHS. Legen Sie die im AH-KROHS gemischten Larven mit einer großen Kolbentransferpipette auf die Mitte einer 3,5 Zentimeter großen Video-Bildschale mit Glasboden Unter einem Stereomikroskop positionieren Sie die Larven schnell auf dem Rücken. Entfernen Sie mit einer Mikroladespitze zusätzliche AH-KROHS, um die dünnstmögliche AH-KROHS-Schicht zu erhalten.
Sobald AH-KROHS erstarrt ist, fügen Sie 2,5 Milliliter Bildmedium hinzu. Für die In-vivo-Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in eindringenden Glioblastomzellen wird die Videobildschale mit den in AH-KROHS eingebetteten xenografierten Larven in die Umweltkammer eines inversen konfokalen Mikroskops mit einer Temperatur von 32 Grad Celsius platziert. Finden Sie die Larven in der Videobildschale mit einem 10x-Objektiv mit einem motorisierten XY-Tisch.
Drücken Sie Escape, um den Objektivturm abzusenken und Mineralöl auf ein 60-faches Ölobjektiv zu geben, und drücken Sie Escape, um zur ursprünglichen Fokusposition zurückzukehren. Beobachten Sie die eindringenden Glioblastomzellen im roten Kanal, der auf 561 Nanometer Laserquelle, 20% Laserleistung und eine Belichtungszeit von 200 Millisekunden eingestellt ist. Wählen Sie dann eine Zelle mit einem ausgebreiteten Mikrotubuli-Netzwerk und leicht unterscheidbaren Mikrotubuli-Filamenten aus.
Legen Sie die Einstellungen der Z-Serie fest. Wählen Sie mit einer Piezostufe im Bereich von 200 Mikrometern die obere und untere Position des Mikrotubuli-Netzwerks aus, wobei ein 10 bis 30 Mikrometer tiefer Z-Stapel ausreicht, um das mikrobielle Netzwerk im Vorsprung der migrierenden Zelle mit einem Z-Schichtschritt von 0,3 Mikrometern sichtbar zu machen. Stellen Sie die Einstellungen für die Zeitrafferaufnahme ein, um ein optimales Gleichgewicht zwischen Aufnahmegeschwindigkeit, Z-Stack-Tiefe und Fluoreszenzsignal zu ermöglichen, um eine schnelle Fotobleiche zu vermeiden.
Nehmen Sie alle fünf bis 10 Sekunden mehrere Minuten lang Bilder der Mikrotubuli auf und speichern Sie den 5D-Hyperstapel. Die Dynamik der Mikrotubuli wurde gemessen, indem ein Kymograph entlang wachsender und schrumpfender Mikrotubuli gebaut und einzelne Mikrotubulikanten im Laufe der Zeit manuell verfolgt wurden. Die im Larvenmedium verabreichte medikamentöse Behandlung und ihre reversible Wirkung auf die Organisation des Mikrotubuli-Netzwerks wurde durch Behandlung mit einer 200-Nanomolaren Dosis Nocodazol bewertet.
Dies führte zu einer fortschreitenden Schrumpfung des Mikrotubuli-Netzwerks und zum Verschwinden der Glioblastom-Zellprotrusion nach vier Stunden. Das Auswaschen des Medikaments stellte die Fähigkeit der Glioblastomzellen zur Bildung von Vorsprüngen wieder her. Die Zellen wanderten 12 Stunden nach dem Auswaschen wieder entlang des Gefäßsystems, was darauf hindeutet, dass eine Dosis von 200 Nanomol Nocodazol ausreichte, um das Mikrotubuli-Netzwerk zu stören und die In-vivo-Glioblastom-Zellinvasion schnell zu blockieren.
Eine dreitägige Analyse der gleichen Behandlung zur globalen Glioblastom-Zellinvasion ergab, dass das Nocodazol die langfristige Glioblastom-Zellinvasion in vivo stoppte, ohne die allgemeine Gesundheit der Fische im Vergleich zu einer Kontrolle zu beeinträchtigen. Denken Sie daran, mit gesunden Larven drei Tage nach der Befruchtung zu beginnen, um die Zellen in der Kapillare zu konzentrieren, das in das Gehirn injizierte Volumen zu minimieren und eine einzigartige Tumormasse zu bilden, und versuchen Sie, die Injektion in die Hirnventrikel zu vermeiden.
