Dieses Protokoll liefert Informationen über die Progression des Tumormodells auf zerstörungsfreie Weise. Es gibt auch Hinweise auf eine therapeutische Reaktion durch ganze Medikamentenregime innerhalb einzelner Aggregate, anstatt sich auf Altersübereinstimmungsproben zu verlassen. Herkömmliche Methoden zur Ermittlung der Zelldichte und Lebensfähigkeit innerhalb von Aggregaten erfordern eine Probenfixierung und -sektion, während unsere Daten zerstörungsfrei liefert.
So können Änderungen innerhalb eines einzigen Aggregats im Laufe der Zeit verfolgt werden. Es wird erwartet, dass diese Technik unser Verständnis der Arzneimittelreaktion in diskreten Regionen von Aggregatmodellen verbessern wird, mit Auswirkungen darauf, wie gut diese Modelle In-vivo-Reaktionen und Arzneimittelscreening-Anwendungen widerspiegeln. Bereiten Sie zunächst 70 bis 90%ige Konfluenzzellkulturen der gewünschten Zelllinien unter Standardbedingungen vor.
Lösen Sie Zellmonoschichten nach der Standard-Trypsinisierungsmethode von ihren Kulturkolben und fügen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen hinzu. Geben Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zu einem Hämozytometer und zählen Sie per Mikroskopie, um die Anzahl der Zellen in der Suspension zu bestimmen. Pelletzellen mittels Zentrifugation und Resuspende von Zellen in Medien in der gewünschten Konzentration von 2,5 mal 10 bis zur fünften Zelle pro Milliliter.
Für Suspensionen, die mit der Basalmembranmatrix hergestellt wurden, entfernen Sie die Matrixdurchstechflasche aus dem Lager von minus 20 Grad Celsius und stellen Sie sie in den Kühlschrank, um über Nacht aufzutauen. Bereiten Sie einen Behälter mit Wachstumsmedien vor und kühlen Sie ihn 10 Minuten lang abkühlen. Unter Verwendung einer gefrorenen Pipettenspitze fügen Sie die Matrix zu gekühlten Medien hinzu, so dass die Endkonzentration dieser Lösung 5% beträgt. Fügen Sie 50 Mikroliter dieses Mediums zu jeder Vertiefung einer runden Boden-, nicht anhaftenden 96-Well-Platte hinzu, so dass die endgültige Konzentration der Matrix in diesen Vertiefungen nach Zugabe von Zellsuspension 2,5% beträgt.
Für Suspensionen, die ohne Matrix hergestellt wurden, fügen Sie 50 Mikroliter reines Wachstumsmedium zu jeder Vertiefung hinzu. Geben Sie 50 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung. Zentrifen Sie die Platten bei 123 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur unmittelbar nach der Aussaat, um die Sammlung eines Zellpellets am Boden jedes Bohrlochs sicherzustellen.
Verwenden Sie ein OCT-System für die strukturelle Bildgebung. Legen Sie die A-Scanrate für die hochauflösende Bilderfassung auf 5,5 Kilohertz fest. Setzen Sie den Brechungsindex für Proben in einem flüssigen Medium auf 1,33.
Legen Sie im Bildparameterfenster auf der rechten Seite des Bildschirms das Sichtfeld fest, indem Sie X-, Y- und Z-Werte so eingeben, dass das Beispiel in diesem interessierenden Bereich enthalten ist. Klicken Sie auf 3D-Erfassungsmodus und dann auf Aufzeichnen, um den 3D-Volumenscan der Probe zu erfassen. Um eine Volume-Rekonstruktion zu erstellen, öffnen Sie Imaris und navigieren Sie zur konvertierten TIF-Datei in ihrer Arena.
Wechseln Sie zu Bearbeiten, klicken Sie auf Bildeigenschaften, und geben Sie die Voxelgröße aus dem OAT-Bild in die entsprechenden XYZ-Felder ein. Klicken Sie anschließend auf OK. Klicken Sie über dem Objektbaum auf Neue Flächen hinzufügen (Add New Surfaces). Klicken Sie im Menü unter dem Baum auf Automatische Erstellung überspringen und bearbeiten Sie manuell.
Schieben Sie im Fenster zur Bildschirmanpassung manuell die roten und schwarzen Pfeile, um den Kontrast zwischen dem Beispiel und dem Hintergrund zu verbessern und die Beispielvisualisierung zu verbessern. Passen Sie die Segmentposition an einer Kante der Probe an das Segment an. Verwenden Sie die Esc-Taste, um die Maus vom Navigationsmodus in den Auswahlmodus zu wechseln und klicken Sie dann auf Zeichnen.
Verfolgen Sie manuell den Umriss des Bereichs, in dem das Signal angezeigt wird. Verschieben Sie die Segmentposition, indem Sie die nächste Position in das Eingabefeld eingeben. Diese nächste Position sollte kleiner oder gleich 100 Scheiben weiter in der Probe sein als die vorherige.
Verfolgen Sie manuell den Bereich, in dem das Signal angezeigt wird. Wiederholen Sie diesen Schritt durch die Dicke der Probe, bis die gegenüberliegende Kante der Probe erreicht ist. Klicken Sie dann auf Oberfläche erstellen und das linke Menü, um diese Segmente zusammenzufügen.
Klicken Sie abschließend auf Bearbeiten, dann auf Maskenauswahl und dann auf OK, um die Volume-Rekonstruktion abzuschließen. Um die Gesamtzelldichte der Probe zu ermitteln, wählen Sie Neue Flecken hinzufügen aus. Deaktivieren Sie im Menü "Algorithmuseinstellungen" alle Kontrollkästchen.
Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um zum Quellkanalbildschirm zu gelangen. Wählen Sie im angezeigten Dropdown-Menü den maskierten Kanal aus. Geben Sie den durchschnittlichen Zelldurchmesser für die Probe in das Feld XY-Durchmesser ein.
Stellen Sie sicher, dass die Hintergrundsubtraktion überprüft wird. Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um zum Bildschirm des Klassifizierungsspots zu gelangen. Klicken Sie im Diagramm unten im Menü auf den linken Rand des gelben Schwellenwerts, und ziehen Sie ihn an den linken Rand des Diagramms, sodass alle Objekte in den gelb schattierten Schwellenwert einbezogen werden.
Klicken Sie dann auf den grünen Pfeil, um die Spot-Erstellung abzuschließen. Rufen Sie die Anzahl der identifizierten Objekte ab, indem Sie auf Statistiken klicken. Klicken Sie dann auf Gesamt und schließlich auf Gesamtzahl der Spots.
Klicken Sie auf die erzeugte Fläche, und navigieren Sie zur Registerkarte Oberflächenstilqualität. Ändern Sie die Auswahl in den Mittelpunkt und ändern Sie die Pixelbreite in weniger als 20, um die beste Sichtbarkeit zu gewährleisten. Navigieren Sie zu Statistiken.
Klicken Sie dann auf Detailliert, gefolgt von Position und zeichnen Sie die Position an der zentralen Stelle auf. Wählen Sie im Menü über dem Objektbaum die Option Neuen Bezugsrahmen hinzufügen (Add New Reference Frame). Überprüfen Sie die sichtbaren und festen Kästchen neben dem X, Y im Menü.
Klicken Sie auf die Mitte des Referenzrahmensymbols, und ziehen Sie sie so, dass sie mit der mittleren Stelle übereinstimmt. Deaktivieren Sie die sichtbaren und fixierten XY-Boxen und wählen Sie sie für XZ aus. Klicken und ziehen Sie erneut die Mitte des Referenzrahmensymbols, sodass sie mit dem mittleren Punkt übereinstimmt. Wiederholen Sie dies schließlich für die YZ-Ebene und wechseln Sie zwischen diesen drei festen Ebenen, bis das Bezugssystem perfekt mit dem Mittelpunkt übereinstimmt.
Doppelklicken Sie im Objektbaum auf den Bezugsrahmen und benennen Sie ihn zentriert oder ähnlich um. Klicken Sie auf die erstellten Spots und navigieren Sie zu Statistiken. Klicken Sie dann auf Detailliert und anschließend auf Position Reference Frame.
Klicken Sie auf Position X Referenzrahmen, bis es vom höchsten zum niedrigsten Wert sortiert wird. Notieren Sie den höchsten Wert, um den Radius der Aggregate zu erhalten. Führen Sie manuelle Berechnungen durch, um zusätzliche Standorte von Interesse zu bestimmen.
Addieren Sie dazu den X-Mittelwert um 100 Mikrometer und verwenden Sie dann die Y- und Z-Werte des Mittelpunkts, um die erste Position entlang der Mittelachse zu definieren. Wählen Sie Neue Spots hinzufügen aus. Wählen Sie dann Automatische Erstellungsbearbeitung manuell überspringen aus.
Halten Sie die Umschalttaste auf der Tastatur gedrückt und klicken Sie auf eine beliebige Stelle auf dem Bildschirm, um eine neue Stelle zu platzieren. Geben Sie die XYZ-Positionswerte für den ersten gewünschten Ort ein. Wählen Sie dann Neuen Bezugsrahmen hinzufügen aus, und richten Sie ihn über der Stelle aus.
Fügen Sie jeder sequenziellen X-Position 100 Mikrometer hinzu. Platzieren Sie das letzte Bezugssystem weniger als 50 Mikrometer vom äußeren Radius der Probe entfernt. Klicken Sie auf die erstellten Spots und navigieren Sie zu Statistiken.
Klicken Sie in der unteren rechten Ecke des Menüs auf Alle Statistiken in Datei exportieren und speichern Sie die Daten in einer Tabelle. Öffnen Sie die Tabelle. Navigieren Sie zur Registerkarte Entfernung vom Ursprungsreferenzrahmen.
Verwenden Sie die mod-Funktion, um jeden Abstand numerisch dem entsprechenden Bezugssystem zuzuordnen. Filtern Sie die Werte in dieser Spalte, um mit den Abständen in jedem Bezugssystem zu arbeiten. Berechnen Sie für jeden der Referenzrahmen die Anzahl der Objekte innerhalb von 50 Mikrometern des Rahmens mit der Funktion ZÄHLENWENN.
Der resultierende Wert entspricht der Anzahl der Zellen in diesem regionalen Plug. Teilen Sie diesen Wert durch das Volumen des 100-Mikrometer-Steckers, um die Zelldichte zu erhalten. Die T-Tests von Student zeigten eine signifikant höhere Zelldichte im Sphäroidkern als in den Übergangs- und Außenschichten für MDA-MB-231-Sphäroidmodelle.
Das Ergebnis zeigt eine Verdichtung in diesem Sphäroidkern nach vier Tagen an. Sowohl innerhalb der AU565- als auch der MDA-MB-231-Aggregatmodelle scheint die Addition der Matrix das Volumen oder die Zellzahl nicht zu beeinflussen und scheint daher einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Zellproliferation zu haben. Vielmehr scheint die Matrixaddition die Zelldichte neu zu verteilen, was eine signifikante Kernverdichtung und eine abnehmende Zelldichte in den äußeren Schichten fördert.
Diese Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in die physikalischen Mechanismen, durch die die Matrix die Zellaggregation in verschiedenen Brustkrebszelllinien ermöglicht. Als nächstes wurden AU565-Tumore mit Matrix hergestellt, reife Aggregate wurden mit Trastuzumab behandelt und die regionale Zelldichte wurde durch ein fünftägiges Medikamentenregime bewertet. Die Stecker wurden alle 100 Mikrometer über die gesamte Dicke der Aggregate gesetzt.
Geringfügige Schwankungen der Zelldichte wurden im Laufe der Zeit innerhalb der inneren 500 Mikrometer jedes Aggregats beobachtet, was auf einen minimalen Zelltod hinweist. Die Visualisierung des Zelltods als indikative Arzneimittelreaktion hauptsächlich in den äußeren Schichten von Tumorsphäroiden steht im Einklang mit den Arzneimittelpenetrationsproblemen von Trastuzumab. Wir können jetzt die Zelllebensfähigkeit in Aggregaten zerstörungsfrei messen, ohne die Struktur zu beeinträchtigen.
Dies ermöglicht die Beurteilung der longitudinalen Arzneimittelreaktion in einzelnen Tumoraggregaten, um die zeitlichen und Penetrationsqualitäten von Kandidaten-Krebsmedikamenten zu identifizieren.
