Dieses Protokoll ermöglicht die bequeme Herstellung von Chitosan-Mikrogelen ohne toxische Lösungsmittel, die für eine Vielzahl von Tissue-Engineering- und Drug-Delivery-Anwendungen verwendet werden können. Diese Technik erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Schulung und erfordert keine toxischen Emulsionstechniken oder Lösungsmittelspülungen, wodurch sie hochgradig biokompatibel und auf eine klinische Umgebung übertragbar ist. Wir haben diese Technik als Biomaterialstrategie zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen angewendet.
Wir glauben jedoch, dass diese Technik auch in anderen Anwendungen der regenerativen Medizin nützlich sein wird. Diese Technik kann auf andere Anwendungen der regenerativen Medizin angewendet werden, die von einem injizierbaren, biologisch abbaubaren Biomaterial-Gerüstsystem mit dem Potenzial für eine anhaltende Wirkstofffreisetzung profitieren würden. Beginnen Sie mit der Zugabe von Essigsäure und gereinigtem Chitosan zu einer 10-Milliliter-Luer-Lockspritze, um eine Chitosanlösung mit einem Gewicht von 6% zu bilden.
Verbinden Sie mit einem weiblichen Luer-Lock-Stecker zwei Luer-Lock-Spritzen und mischen Sie die Lösung dann hin und her, bis sich das Chitosan in der Asketsäure vollständig aufgelöst hat. Geben Sie nun 100 Mikroliter der Genipinlösung in die Chitosan-haltige Spritze und mischen Sie 30 Sekunden lang zwischen den Spritzen hin und her, dann werfen Sie die Mischung aus der Spritze auf eine 35-Millimeter-Petrischale. Die Petrischale mit Paraffinfolie abdecken und über Nacht bei 37 Grad Celsius in befeuchteter Atmosphäre inkubieren.
Verwenden Sie einen Spatel, um das Hydrogel in kleinere Stücke zu brechen, und legen Sie dann einen Filter der gewünschten Maschenweite in die Rückseite einer sauberen 10-Milliliter-Spritze. Die zerbrochenen Gelstücke in die mit dem Filter versehene Spritze geben und 6 Milliliter doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Verbinden Sie die Spritze über einen Luer-Schlossanschluss mit einer anderen sauberen 10-Millimeter-Spritze.
Drücken Sie das Gel-Wasser-Gemisch durch die Spritze mit dem Filter, um Mikrogele zu erzeugen. Öffnen Sie nach der ersten Filtration die Spritze mit dem Filter und geben Sie die Mischung wieder in diese Spritze. Zwingen Sie das Gemisch erneut durch den Filter.
Übertragen Sie nun die gefilterte Gelmischung in ein konisches 50-Milliliter-Rohr und fügen Sie doppelt destilliertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 20 Milliliter zu bringen. Wirbeln Sie die Lösung um, um eine homogene Lösung zu erhalten. Die Mikrogele bei 100 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Entfernen Sie nach der Zentrifugation die obere wässrige Phase und resuspendieren Sie die Mikrogele in 10 Millilitern 70% Ethanol, dann wirbeln Sie die Mikrogele auf und legen Sie sie eine Stunde lang unter UV-Licht, um sie zu sterilisieren. Zentrifugieren Sie nun die Mikrogele bei 1000 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Ethanol und spülen Sie es 3 Mal mit doppelt destilliertem Wasser ab.
Resuspendiert die Mikrogelpellets in einem gleichen Volumen doppelt destilliertem Wasser. Mit dem Anstieg des pH-Wertes zeigten die Mikrogele eine Abnahme der Schwellung, wie sie durch die Änderung des Feret-Durchmessers dargestellt wird. Auch die Größe der Mikrogelpartikel hängt von der Porengröße des verwendeten Filters ab.
Nummer 200 Mesh produzierte kleine Partikel, während Nummer 100 Mesh zu großen Partikeln führte. Das Vorhandensein von Mikrogelen an der verletzten Stelle förderte die Knorpelregeneration. Die Färbung von Alcian Blue Hämatoxylin zeigte, dass Mikrogele, die in das verletzte Gewebe injiziert wurden, eine frühe Knochenstabbildung verhinderten und Mikrogele, die mit den bioaktiven Wirkstoffen SDF-1a und TGF-B3 beladen waren, die Knorpelbildung förderten.
Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Drahtgeflechtfilter korrekt in die Spritze eingesetzt wird, damit eine effektive Filterung stattfinden kann. Es ist auch wichtig, die Filtration einige Male zu wiederholen, um eine homogene Verteilung der Mikrogelgröße zu gewährleisten. Diese Mikrogele können auf eine Vielzahl von Tissue-Engineering-Anwendungen angewendet werden, die ein Biomaterial-Gerüstsubstrat erfordern, das das Potenzial für eine anhaltende Freisetzung von Therapeutika hat.
