Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

Es gibt mehrere Methoden, um die ROS-Produktion oder den oxidativen Stress in Zellen zu messen. Unter diesen ist die 2'7'Dichlorfluorescein-Diacetatsonde eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur direkten Messung des Redoxzustands. Diese Sonde ist lipophil und nicht fluoreszierend. Die Diffusion dieser Sonde über die Zellmembran ermöglicht der intrazellulären Esterase eine Spaltung an den beiden Esterbindungen, wodurch ein relativ polares und zellmembranundurchlässiges Produkt entsteht. Diese nicht-fluoreszierenden Moleküle reichern sich intrazellulär an, und die anschließende Oxidation durch ROS ergibt das hochfluoreszierende Produkt Dichlorfluorescein. Die Oxidation der Sonde ist das Produkt der Wirkung mehrerer Arten von ROS. Die durch Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden kann. In diesem Artikel haben wir eine Dichlorfluorescein-Diacetatsonde verwendet, um ROS durch Durchflusszytometrie zu messen und zu quantifizieren. Übertragen Sie 6-Well-Platten aus dem Inkubator in eine Laminar-Flow-Haube. Aspirieren Sie den Überstand. Und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie 2 ml niedriges Serum-DMEM pro Vertiefung hinzu. Und inkubieren Sie die 6-Well-Platte für zwei Stunden im Inkubator. Behandeln Sie die Zellen sechs Stunden lang mit dem Antioxidans. Behandeln Sie die Zellen 30 Minuten lang mit dem ROS-Induktor, A oder B. Aspirieren Sie den Überstand. Und waschen Sie die Zelle dreimal mit PBS, um alle Reize zu entfernen. Schalten Sie das Licht der Laminar-Flow-Haube aus und arbeiten Sie in der Dunkelheit. Fügen Sie 1 ml Dichlorfluorescein-Diacetatsonde in DMEM ohne Phenolrot hinzu. Fügen Sie 1 ml DMEM ohne Phenolrot zu den Kontroll-Autofluoreszenz-Kontrollzellen hinzu. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte für 30 Minuten im Inkubator. Überführen Sie die Platten auf Eis ins Labor. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 2 ml kaltem PBS pro Well. Fügen Sie jedem Bohrloch 0,5 ml kalt ablösenden Puffer hinzu. Ernten Sie die Zellen, indem Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren. Sammeln Sie sie in einem beschrifteten 1,5-ml-Röhrchen. Und zentrifugieren Sie sie bei 600 x g für fünf Minuten bei 4 ° C.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und dissoziieren Sie das Pellet vorsichtig mit Klopfen. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu jedem markierten Röhrchen zu waschen. Wenn es notwendig ist, verwenden Sie Wirbel in der niedrigsten Intensität für die vollständige Dissoziation des Pellets. Zentrifugieren Sie sie bei 600 x g für fünf Minuten bei 4 C.Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Insgesamt drei Wäschen. Resuspendieren Sie Zellpellets in 200 l FACS-Puffer. Dissoziieren Sie das Pellet in jedem Rohr vorsichtig vollständig, indem Sie einen Wirbel verwenden. Und auf beschriftete 5 ml für Durchflusszytometerröhren übertragen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis sie auf dem Durchflusszytometer analysiert werden. Erstellen Sie mit der Durchflusszytometrie-Software ein neues Experiment. Klicken Sie auf das Exemplar und es wird eine Liste der Röhrchen geöffnet. Doppelklicken Sie auf sie und benennen Sie sie um. Legen Sie die Autofluoreszenz-Kontrollröhre auf den Aspiratorarm und bewegen Sie die Basis vorsichtig nur nach links. Klicken Sie auf Daten erfassen und dann auf Daten aufzeichnen, und wählen Sie die gewünschte Stoppbedingung aus. Zeichnen Sie ein Tor um die Zellen von Interesse, ohne tote Zellen und Ablagerungen. Entfernen Sie die Röhre. Klicken Sie auf Nächste Röhre und führen Sie die Basalkontrollprobe aus. Klicken Sie auf Daten erfassen und dann unter Daten aufzeichnen.Öffnen Sie die Software. Fügen Sie die Beispiele mithilfe der Aktionsschaltfläche "Beispiele hinzufügen" hinzu. Klicken Sie auf Beispiel hinzufügen.Wählen Sie den Ordner Experimentelles Datum aus, und klicken Sie auf Auswählen.Doppelklicken Sie auf die erste Probe in Ihrem Arbeitsbereich, in diesem Fall auf die Autofluoreszenzsteuerung. Zeichnen Sie ein Polygon-Tor, um die Zelle von Interesse zu isolieren, ohne tote Zellen und Ablagerungen. Ändern Sie das Diagramm in ein Histogramm. Doppelklicken Sie innerhalb des M