Rekombinante Gliedmaßen sind ein leistungsfähiges Modell für eine Studie im Prozess der Zelldifferenzierung und Kraftbildung unter dem Einfluss embryonaler Signale in einer In-vivo-Umgebung. Dieser Assay ermöglicht mehrere Variationen, die potenzielle Anwendungen ermöglichen, ohne auf die Entwicklungsbiologie der Hühnergliedmaßen beschränkt zu sein. Es kann auf andere Stängel oder Vorläufer von anderen Organismen angewendet werden.
Entfernen Sie zunächst die Eier nach dreieinhalb Tagen aus dem Inkubator, tupfen Sie sie mit 70% Ethanol ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Als nächstes identifizieren und lokalisieren Sie die sich entwickelnden Embryonen, indem Sie das Ei kandieren und die Blutgefäße beobachten. Verwerfen Sie Eier, die keinen Embryo haben.
Tippen Sie auf das stumpfe Ende der Eierschale mit dem Ende einer stumpfen Pinzette, um ein Fenster zu öffnen, und entfernen Sie etwa einen Quadratzentimeter der Schale mit der Pinzette. Anschließend die Eier in einen Plastik- oder Kartonhalter geben. Legen Sie die Eier nacheinander unter das Stereomikroskop.
Identifizieren Sie die Luftmembran und entfernen Sie sie, indem Sie ein kleines Loch in dem Bereich ohne Gefäße aufnehmen. Ziehen Sie diesen Bereich mit Hilfe einer feinen chirurgischen Pinzette heraus und entfernen Sie Eierschalenstücke in Kontakt mit dem Embryo. Reißen Sie die Fruchtblase mit einer feinen chirurgischen Pinzette auf.
Entfernen Sie den Embryo vorsichtig mit stumpfer Pinzette aus dem Ei und geben Sie ihn in eine sterile Petrischale mit eiskaltem 1x PBS. Waschen Sie die Embryonen einmal in eiskaltem 1x PBS und ziehen Sie alle verbleibenden Membranen unter dem Stereomikroskop zurück. Suchen Sie dann die Hinterbeinknospen.
Schneiden Sie jede Hinterbeinknospe in Längsrichtung ab und schneiden Sie mit einer feinen chirurgischen Zange sehr nahe an die Embryonenflanke. Aufrechterhaltung der Embryonen in 1x PBS. Dann die Gliedmaßenknospen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kunststoff-Transferpipette überführen.
Als nächstes ersetzen Sie das PBS durch 500 Mikroliter 0,5% Trypsin-Lösung. Inkubieren Sie die Gliedmaßenknospen in einem Thermoblock sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie dann die Trypsinlösung durch 500 Mikroliter von zwei Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ vier in HBSS und inkubieren Sie sie im Thermoblock für weitere acht Minuten.
Entfernen Sie so viel Kollagenase wie möglich und ersetzen Sie es durch einen Milliliter kaltes DMEM mit hoher Glukose mit 10% FBS, um die Enzyme zu inaktivieren. Die Mischung etwa 10 Mal vorsichtig pipettieren. Filtern Sie die Suspension, die die Zellen enthält, mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb, um die Ektoderme hinter sich zu lassen.
Die Suspension nochmals etwa fünf bis 10 Mal pipettieren und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit 200 mal g zentrifugieren. Verwerfen Sie dann den Überstand. Waschen Sie die überschüssige Kollagenase mit einem Milliliter Medien, zentrifugieren Sie dann die Suspension und entsorgen Sie das Medium sorgfältig.
Als nächstes fügen Sie 1,5 Milliliter Medien hinzu, ohne die Zellen zu stören, und inkubieren Sie sie für ein bis 1,5 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem Thermoblock, so dass die Zellen ein kompaktes Pellet bilden können. Nachdem Sie die Hintergliedmaßenknospen erhalten haben, geben Sie sie in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kunststoffpipette. Entfernen Sie überschüssiges 1x PBS und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter 0,5% Trypsin in sterilem 1x PBS.
Inkubieren Sie die Mischung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Thermoblock. Die Trypsinlösung mit den Gliedmaßenknospen in eine sterile Petrischale geben. Dann so viel wie möglich von dem überschüssigen Trypsin entfernen und die Petrischale mit eiskaltem 1x PBS mit 10% FBS überfluten, bis alle Gliedmaßenknospen bedeckt sind.
Identifizieren Sie die Gliedmaßenknospen unter dem Stereomikroskop. Als nächstes identifizieren Sie das Ektoderm als eine leicht abgelöste transparente Membran von den mesodermalen Zellen der Gliedmaßen. Lösen und trennen Sie das Ektoderm mit einer Pinzette, die das proximale Ende der Gliedmaßenknospe mit einer feinen chirurgischen Pinzette hält.
Nehmen Sie das mesodermale Pellet aus den vorherigen Schritten und entsorgen Sie etwa 600 Mikroliter des Mediums. Dann trennen Sie das Pellet vorsichtig mit einer Pipettenspitze, ohne es zu zerschlagen. Drehen Sie das Rohr auf den Kopf, um das Pellet in die Petrischale mit den leeren Ektodermen zu geben.
Schneiden Sie ein kleines Stück des Pellets mit einer feinen chirurgischen Pinzette ab und platzieren Sie es so nah wie möglich am Ektoderm. Öffnen Sie das Ektoderm mit der chirurgischen Pinzette und legen Sie das Pellet so fest wie möglich in die ektodermale Halle. Öffnen Sie die Fruchtblase in der Nähe der Vorderbeine, um die rechte Flanke des Embryos freizulegen.
Führen Sie unter Anleitung der Vordergliedmaßenposition ein Wundkratzen mit einer Wolframnadel bis zu einer Länge von zwei bis drei Somiten durch und beschädigen Sie das Mesoderm leicht, bis es blutet. Übertragen Sie die rekombinanten Gliedmaßen einzeln in den Kükenembryo und legen Sie seine Basis über eine Somitwunde. Befestigen Sie das rekombinante Glied richtig mit zwei Stück Palladiumdraht.
Richten Sie die Basis der rekombinanten Extremität mit der Wunde aus. Versiegeln Sie das Fenster mit Klebeband und bringen Sie das Ei in den Inkubator zurück. Bei erfolgreicher Implantation wurde die rekombinante Extremität als Protuberanzung beobachtet, die sicher an der mesodermalen Wand des Spenderembryos befestigt war.
Im Gegenteil, die rekombinante Extremität löste sich von der mesodermalen Wand oder zeigte eine grobe Morphologie, wenn entweder die Zelllebensfähigkeit oder das Transplantat versagte. Die Alcian-Blau-Färbung zeigte Skelettelemente in einem sechstägigen Huhn, einem hühnerrekombinanten Glied. Bevor das Alcia-Blau gereinigt wurde, wurden Bilder in Ethanol für morphologische und quantitative Messungen erhalten.
H & E-gefärbte oder ungefärbte Gliedmaßen wurden geschnitten, um Gewebe und Zellen zu beobachten. Diese Technik kann Gliedmaßenorganoide in vivo entwickeln und die Zelldifferenzierung oder den morphogenetischen Prozess untersuchen, indem die Stammzellen aus verschiedenen Quellen oder Spezies verwendet werden.
