Wir demonstrieren unzählige Methoden zur optischen Kontrolle und Beobachtung der ausgelösten zellulären Aktivität in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und Toxizitätstest. Ermöglichen Sie eine multiparametrische Quantifizierung der phänotypischen Muster in Zeit und Raum, ermöglichen Sie die Beobachtung der Wirkung von Medikamenten über Stunden oder Tage. Diese Methode kann auf verschiedene Arten von Zellen, wie Neuros oder Betazellen, für funktionelles Screening und Toxizitätstest angewendet werden.
Wan-Chi Su, ein Bio-Imaging-Ingenieur aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Bereiten Sie die Multi-Well-Platte vor, bevor iPSC-Kardiomyozyten zum Auftauen aus dem Kühlhaus entfernt werden. Beschichten Sie jede Vertiefung der 96-Well-Mikroplatte mit 100 Mikrolitern 0,02% Gelatinelösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin, um alle Oberflächen gründlich abzudecken.
Die iPSC-Kardiomyozyten werden aus dem Flüssigstickstoffspeicher in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad überführt. Bringen Sie die Durchstechflasche zu einer Biosicherheitswerkbank der zweiten Klasse und geben Sie den Inhalt vorsichtig in ein neues 15-Milliliter-Konikusröhrchen, das neun Milliliter Medium bei Raumtemperatur enthält. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten bei Raumtemperatur.
Verwerfen Sie den Überstand per Pipette und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig in einem Milliliter Medium mit dem 10-Mikromolaren ROCK-Inhibitor Y27632. Plattenzellen beschichteten 96 Well-Platten mit einer Dichte von 100.000 bis 150.000 Zellen pro Quadratzentimeter gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie nach 24 Stunden sicher, dass die an der Oberfläche der Platte befestigten Zellen mit anderen Zellen in Kontakt kommen.
Nach 72 Stunden Auftauen der Zellen auf Eis. Bereiten Sie eine doppelt starke virale Kit-Stammlösung mit dem Erhaltungsmedium vor. Bereiten Sie die Zellen auf die Infektion vor, indem Sie das mittlere Volumen auf 100 Mikroliter pro Vertiefung einstellen.
100 Mikroliter der vorgemischten Viruslösung in die Vertiefungen geben und acht bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation durch 200 Mikroliter vorgewärmtes Medium ersetzen. Visualisieren Sie die GECIs-Expression 24 Stunden nach der Transduktion mit einem Bildgebungssystem.
Halten Sie die Zellen im befeuchteten Inkubator, bevor funktionelle Assays durchgeführt werden. Schalten Sie alle Geräte des High-Content-Imaging-Systems ein. Stellen Sie sicher, dass die Kammertemperatur 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid-Supplementierung erreicht.
Öffnen Sie die Imaging-Software, und wählen Sie die Platteneinstellung für eine 96-Well-Platte aus. Legen Sie eine 96-Well-Platte ohne Deckel in die Kammer und laden Sie den Dichtungsring der lebenden Zelle. Wählen Sie das 20-fache, 60-fache und 20-fache Wasserimmersionsobjektiv entsprechend der erforderlichen räumlichen Auflösung.
Passen Sie den Fokus an, um vor der experimentellen Aufnahme klare Bilder aufzunehmen. Wählen Sie drei bis fünf Regionen zufällig pro Vertiefung für die Aufzeichnung der Kalziumaktivität aus. Wählen Sie geeignete Filter für verschiedene Indikatoren.
Stellen Sie die entsprechende Leuchtdiodenleistung für jeden verwendeten Bildkanal ein. Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf maximal 40 Millisekunden oder 25 Hertz und eine Aufnahmedauer von 30 Sekunden für die Stromaufnahme ein, um Kalziumtransienten zu beobachten, die von MNG-GECO- und K-GECO-Sonden in Kardiomyozyten angegeben werden. Erhöhen Sie die LED-Leistung, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis bei höheren Bildraten weniger als zwei beträgt.
Für die optogenetische Stimulation optimieren Sie die Leistung und Frequenz des blauen Lichts bei einem Hertz und beginnen Sie mit der Erfassung. E4031 Dofetilide und Verapamil in DMSO wieder suspendieren und mit Tyrodes Puffer verdünnen. Ordnen Sie Verbindungen an der entsprechenden Zielmulde an.
Fügen Sie 100 Mikroliter der doppelt starken Verbindung über das automatische mikrofluidische System in die Vertiefungen hinzu und beginnen Sie nach der gewünschten Inkubationszeit mit der Akquisition. Isolieren Sie den Signalbereich vom Hintergrund, indem Sie die Impulsfunktion automatisch über die Zeitauflösung mit der Software erkennen. Verwenden Sie die Kalziumpeak-Analysesoftware, um die Schlagfrequenz, das Spitzensignal, die vorübergehende Kalziumdauer 50% die vorübergehende Kalziumdauer 90% die Anstiegszeit und die Abklingzeit zu analysieren.
Die Beobachtung der spontanen Kalziumoszillation in NMG-GECO, ausgedrückt durch iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten mit oder ohne medikamentöse Behandlung, wird im Video demonstriert. Kinetische Spuren, die mit MNG-GECO erhalten wurden, zeigten, dass die kleinmolekularen Ionenkanalinhibitoren Verapamil, Dofetilid und E4031 Calciumtransienten wie erwartet beeinflussten. Um die Dosis-Wirkungs-Beziehung von E4031 unter standardisierten, temporeichen Bedingungen zu bewerten, wurden Kanalrhodepsin-2 und K-GECO exprimierende iPSC CMs optisch mit einem Hertz und 470 Nanometer Lichtimpulsen gesteuert und unter Verwendung des roten K-GECO-Signals beobachtet.
Eine fortschreitende Verringerung der Spitzenamplitude und eine Verlängerung der Abklingzeit der Kalziumtransienten treten mit steigenden Konzentrationen von E4031 auf. Ein dosisabhängiger Effekt von E4031 war am deutlichsten für die Verringerung der Spitzenamplitude. Klare Kalziumtransienten bleiben einen Monat nach der viralen Transduktion oder ohne das zusätzliche Licht, das für die optische Stimulierung verwendet wird, sichtbar.
Die Grafik zeigt ein Medikament, das die Schlagrate zu erhöhen, das Kontraktionsintervall zu regulieren und die transiente Kalziumamplitude im LVNC iPSC CM-Modus zu erhöhen scheint. Die Variabilität der Schlagfrequenz und der daraus resultierende Einfluss auf die vorübergehende Kalziumdauer ändern sich ebenfalls, wenn iPSC CM in Kultur erhalten bleiben. Mehrere GECIs, darunter ER LAR-GECO, MTG-Sepia und NIR-GECO, wurden für die Expression einzeln oder in Kombination in Zellmodellen zur Echtzeitmessung der Kalziumaktivität im endoplasmatischen Retikulum, sarkoplasmatischen Retikulum, Mitochondrien und Zytosol entwickelt.
Die GECIs können im iPSC CM-Modell kombiniert werden, um verschiedene intrazelluläre Kalziumspeicher zu untersuchen. K-GECO exprimierende Kardiomyozyten zeigten im Laufe der Zeit ein konsistentes Schlägeverhalten. Die Belastung von Fluo-4 beeinflusste jedoch sowohl die Schlagfrequenz als auch die CTD in diesem Modell, was darauf hindeutet, dass Fluo-4 selbst die Ergebnisse solcher Experimente beeinflussen könnte.
Wir bieten eine einfache Möglichkeit, phänotypische Profile von Kontroll- und Patientenzellen zu untersuchen, während iPSC-Zwischenprodukte Aufschluss über die Arzneimittelforschung bei verschiedenen Krankheiten geben können.
