Dieses Protokoll bietet eine Technik zum Nachweis der Speichelproteine von Zikaden und Pflanzenwirten, um die Funktion dieser Proteine in den Pflanzenwirten weiter zu untersuchen. Diese Technik ist einfach durchzuführen und das System ist stabil und replizierbar. Diese Methode könnte auch bei der Detektion von Speichelproteinen anderer Hemiptera und pflanzlicher Wirte hilfreich sein.
Ziehen Sie zunächst die erwachsenen Zikaden auf Reissetzlingen in einem 40 x 35 x 20 Zentimeter großen Würfelkäfig auf. Halten Sie eine Seite des Käfigs zur Belüftung mit einem insektensicheren Netz bedeckt. Stellen Sie die Käfige mit den Zikaden in einen Inkubator mit eingebautem Feuchtigkeitsregler bei 26 Grad Celsius und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 bis 75 % unter einer Fotoperiode von 16 Stunden hell und acht Stunden dunkel.
Verwenden Sie einmal pro Woche einen Absauger, um alle Erwachsenen vorsichtig aus ihrem Käfig in einen neuen Käfig mit frischen Reissetzlingen zu bringen. Lassen Sie mehr als 200 Erwachsene sich paaren und Eier in den Reis legen. Bewahren Sie die alten Reissetzlinge auf, damit die Nymphen schlüpfen können, und ziehen Sie diese neuen nicht-viruliferen Nymphen in das zweite Stadium auf.
Übertragen Sie die nicht-viruliferen Nymphen im zweiten Stadium vorsichtig mit dem Aspirator für ein bis zwei Stunden in ein Glaskulturröhrchen, damit sie verhungern. Lassen Sie dann die Nymphen in einen Käfig mit einer mit dem Reiszwergvirus infizierten Reispflanze frei, die in einem Topf angebaut wird, und lassen Sie die Nymphen zwei Tage lang von der infizierten Reispflanze fressen. Setzen Sie diese Nymphen nach zwei Tagen vorsichtig in einen neuen Käfig um, der frische virusfreie Reiskeimlinge enthält, und lassen Sie die Nymphen 12 Tage lang von den virusfreien Reissämlingen fressen, um die zirkulative Übertragungszeit des Reiszwergvirus abzuschließen.
Um die Speichelproteine zu sammeln, bereiten Sie fünf kleine röhrenartige Futterkäfige vor, die an einem Ende mit insektensicheren Netzen bedeckt sind. Nachdem Sie 15 bis 20 Zikaden in jedem Futterkäfig eingesperrt haben, decken Sie das andere Ende des Käfigs mit einer dünnen Schaumstoffmatte ab. Befestigen Sie einen Reissetzling zwischen dem Ende des Käfigs und einer Schaumstoffmatte mit Klebebändern und stellen Sie sicher, dass sich die Zikaden im Futterkäfig von den Reissetzlingen ernähren können, die dem Inneren des Käfigs ausgesetzt sind.
Tauchen Sie die Sämlingswurzeln in Wasser, damit die Reispflanze am Leben bleibt, und lassen Sie die Zikaden sich zwei Tage lang davon ernähren. Nehmen Sie die Zikaden nach zwei Tagen aus ihren Futterkäfigen und sammeln Sie die Reissetzlinge ein, von denen sich die Zikaden ernährt haben. Schneiden Sie die Sämlinge außerhalb des Käfigs ab und stellen Sie die Fraßregionen der Sämlinge wieder her.
Bereiten Sie 1x Tris-Glycin-Puffer vor, indem Sie 200 Milliliter des vorbereiteten 5-fach-Puffers mit 800 Millilitern sterilem Wasser verdünnen. Bereiten Sie dann 10x TBS-Puffer vor und autoklavieren Sie die Lösung bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Als nächstes bereiten Sie den 4-fachen Proteinprobenpuffer vor.
Bereiten Sie dann den Transferpuffer vor, indem Sie 800 Milliliter des Tris-Glycin-Puffers mit 200 Millilitern Methanol mischen. Zum Schluss bereiten Sie die TBST-Lösung vor, indem Sie 100 Milliliter 10x TBS und drei Milliliter Tween 20 bis 900 Milliliter steriles Wasser hinzufügen. Um die Speichel- und Virusproteine nachzuweisen, mahlen Sie 0,1 Gramm der Reisproben mit flüssigem Stickstoff, bis das Gewebe zu einem Pulver wird.
Dann 200 Mikroliter des 4x Proteinprobenpuffers in die Probe geben und 10 Minuten kochen lassen. Zentrifugieren Sie die Proben und übertragen Sie den Überstand in ein neues Fläschchen. Laden Sie 10 Mikroliter der Probe auf ein SDS-PAGE-Gel und lassen Sie es 45 bis 60 Minuten lang in Tris-Glycin-Puffer bei 150 Volt laufen.
Während das Gel läuft, legen Sie eine 0,45-Mikron-Nitrozellulosemembran und andere Sandwich-Vorräte für 30 Minuten in den Transferpuffer. Nach dem Lauf das Gel einschließen und für 90 bis 120 Minuten bei 100 Volt in den Transferpuffer geben. Nachdem der Blotting abgeschlossen ist, legen Sie die Membran in eine 7%ige fettfreie Trockenmilchblockerlösung in TBST und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang.
Danach fügen Sie einen Antikörper gegen das Reiszwergvirus P8 oder Vitellogenin hinzu und inkubieren die Membran für zwei Stunden oder über Nacht. Waschen Sie die Membran nach der Inkubation dreimal mit TBST mit einer fünfminütigen Inkubation zwischen jedem Waschgang. Fügen Sie dann Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG als sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Membran für 60 bis 90 Minuten.
Verwenden Sie das ECL Western-Kit für die Chemilumineszenz-Detektion in gemischten Detektionsreagenzien eins und zwei im Kit in einem Verhältnis von eins zu eins. Legen Sie die Membran auf das gemischte Reagenz und inkubieren Sie den Blot fünf Minuten lang. Lassen Sie das überschüssige Reagenz ab und machen Sie ein chemilumineszierendes und kolorimetrisches Bild der Membran.
Kombinieren Sie die Bilder, um letzteres mit Proteinbanden zu sehen. Western-Blot-Analysen zum Nachweis von Vitellogenin zeigten spezifische und erwartete Banden von etwa 220 Kilodalton bei der Fütterung von Reispflanzen und Speicheldrüsen der Insekten. Im Gegensatz dazu wurde bei den nicht fressenden Pflanzen keine Bande beobachtet, was darauf hindeutet, dass Vitellogenin im Pflanzenwirt als Speichelprotein freigesetzt wurde.
Die Western-Blot-Analyse zum Nachweis des P8-Proteins des Reiszwergvirus zeigte eine spezifische und erwartete Bande von etwa 46 Kilodalton in Futterpflanzen und viruliferen Insektenkörpern. Im Gegensatz dazu wurde bei nicht-fressenden Pflanzen und nicht-viruliferen Zikadenkörpern keine Bande beobachtet, was beweist, dass die viralen Proteine auch in den fressenden Pflanzen nachgewiesen werden konnten. Die Virusbelastung in den Zikaden, der Nachweiszeitpunkt und die Wiederholungen sollten bei der Durchführung dieses Protokolls berücksichtigt werden.
Diese Methode kann auch zur Untersuchung von Stechmücken angewendet werden, die Arboviren übertragen.
