Verletzungen des offenen Globus können zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führen, wenn sie unbehandelt bleiben. Dieses Vordersegment-Organkulturmodell ermöglicht die Beurteilung dieser Verletzungen im Rahmen der Notwendigkeit von Tierversuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Verfolgung von Open-Globe-Verletzungen und Therapeutika, um die Verletzung für drei oder mehr Tage mit einer Organkulturplattform zu stabilisieren.
Trent Pearson, ein Forschungstechniker aus dem Dr. Boice-Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Legen Sie zunächst den chirurgischen Vorhang und die Instrumente, die für die grobe Dissektion erforderlich sind. Stellen Sie die Bio-Sicherheitswerkbank auf, um die Augen auf dem Seziermikroskop zu visualisieren.
Stellen Sie die Bio-Sicherheitswerkbank für die Schalenmontage ein. Richten Sie den Arbeitsbereich für die Induktion von Verletzungen mit offenem Globus in der Bio-Sicherheitswerkbank ein. Positionieren Sie den Cross-Tracking-Schraubstock auf der Laborbuchse vor der Punktionsplattform.
Nach dem Entfernen des zusätzlichen Orbitalgewebes und dem Waschen der Augen mit antibiotischem antimykotischem PBS, um das Auge zu hemisektieren, legen Sie das Auge auf die antibiotische antimykotische PBS-getränkte Gaze. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge oder ein Skalpell, um einen Schnitt in der Nähe des Augenäquators zu erzielen. Dann hemisektieren Sie das Auge mit einer gekrümmten chirurgischen Schere, um das Vorderauge zu isolieren.
Verwenden Sie eine Mikroschere als Schaufel, um den Glaskörper aus dem vorderen Segment zu schöpfen und die Linse mit einer Mikroschere aus dem vorderen Segment zu entfernen. Schneiden Sie die Iris allmählich radial zur Iriswurzel, bis das trabekuläre Geflecht sichtbar ist. Verlängern Sie den Schnitt um 360 Grad um die Iris, um den gesamten trabekulären Netzbereich freizulegen und bei Bedarf die verbleibende Irisreste zu reinigen, die das Trabekelgeflecht bedeckt.
Schneiden Sie die Ziliarkörperreste hinter dem trabekulären Netzbereich ab und hinterlassen Sie nur ein ein Millimeter dünnes Band des Gewebes. Nach dem Platzieren des vorderen Segments in der Petrischale. Befeuchten Sie einen Wattestäbchen im Medium und tupfen Sie vorsichtig in die Mitte der Hornhaut, um Pigmente zu entfernen.
Halten Sie die Augen mit einer Zette und entfernen Sie zusätzliches Pigment um die Sklera durch Abwischen. Legen Sie das umgekehrte vordere Segment über den erhöhten Bereich der unteren Schüssel und stellen Sie sicher, dass die Hornhaut in der Mitte der erhöhten Region bleibt. Positionieren Sie den Klemmring auf dem neu platzierten vorderen Segment und ziehen Sie die Schrauben vorsichtig mit dem L-Schlüssel fest.
Befestigen Sie beide fluidischen Anschlüsse mit O-Ringen an Gewindeanschlüssen an der Unterseite der Schüssel. An dem ersten fluidischen Stecker sind 18 Gauge 90 Grad gebogene Nadelnabe, eine Länge des Schlauches, eine 18 Gauge Nadelnabe, ein Nylonspritzenfilter, ein Drei-Wege-Ventil und eine 20 Millimeter Spritze mit Medien gefüllt. An den zweiten fluidischen Stecker befestigen Sie eine 18 Gauge 90 Grad gebogene Nadelnabe, eine Schlauchlänge, eine 18 Gauge Nadelnabe, ein Drei-Wege-Ventil, wie für den ersten Fluid-Stecker demonstriert, und befestigen Sie dann den Fassteil einer sterilen 10-Milliliter-Spritze, die als Reservoir zum Auffangen der Flüssigkeit und der Blasen fungiert.
Halten Sie die Dreiwegeventile entsprechend zu den Spritzen geöffnet, drücken Sie das Medium vorsichtig durch das System, indem Sie den ersten Fluidics-Anschluss verwenden. Um das vordere Segment aufzublasen, füllen Sie den Schlauch mit Medien und füllen Sie schließlich das Reservoir. Entfernen Sie die Blasen, indem Sie das Medium vorsichtig in die Schüssel drücken und die Schüssel umkehren, um die Blasen herauszudrücken.
Legen Sie die vordere Organkulturschale in den Zellkulturinkubator. Richten Sie die Schlauchleitungen durch die Unterseite der Inkubatortür aus, um Störungen beim Öffnen und Schließen der Tür zu vermeiden. Positionieren Sie die Schlauchleitungen mit dem Reservoir am Druckaufnehmerinstrument.
Schließen Sie das seitliche Dreiwegeventil an den Druckaufnehmer an, während PBS durch die Leitung fließt, um zu verhindern, dass die Luftblasen in die Schlauchleitungen gelangen. Im Inneren der vorbereiteten Bio-Sicherheitswerkbank für die offene Verletzungsinduktion stellte der Druckregler auf der Punktionsplattform auf 50 Pfund Kraft pro Quadratzoll ein, um eine ausreichende Durchstichkraft auf die Objekte mit einem Durchmesser von bis zu 4,5 Millimetern zu erzeugen. Positionieren Sie den Kreuzverfolgungsschraubstock auf der Laborbuchse vor der Punktionsplattform.
Verlängern Sie den Kolbenarm auf seinen maximalen Abstand und positionieren Sie die Hornhautspitze innerhalb des ein Millimeter großen Bereichs des Punktionsobjekts, ziehen Sie den Kolbenarm ein und bringen Sie das vordere Segment einen Zentimeter näher an das Punktionsobjekt heran. Um die Einstichvorrichtung zu starten, schalten Sie das Gerät ein und öffnen Sie das Magnetventil mit dem zweiten Schalter am Gerät. Um das Gerät vom Auge zurückzuziehen, drücken Sie den zweiten Schalter, überprüfen Sie die ordnungsgemäße Verletzungsinduktion durch visuelle Inspektion und Medienlecks von der Verletzungsstelle.
Nach der Operation wurde die Integrität des Hornhautepithels mittels bildgebender Anwendung mittels optischer Kohärenztomographie beurteilt. Das verletzte vordere Segmentgewebe wurde unmittelbar nach der Verletzung und 72 Stunden nach der Verletzung abgebildet. Die kontrollierten Augen zeigen keine merkliche Störung in der Hornhaut, während nach der Verletzung klare Verletzungen durch die Hornhaut lokalisiert wurden.
Aus der Top-Down-Projektion der maximalen Intensität war ersichtlich, dass Verletzungen in Form und Größe unregelmäßig waren, aber die Verletzungsgröße wurde über 72 Stunden verringert. Der Augeninnendruck wurde in den ersten drei Tagen vor der Operation beobachtet, um die Druckstabilität im akzeptablen Bereich zu bestimmen. In den repräsentativen Ergebnissen liegen drei von fünf Augen innerhalb des akzeptablen Augendruckbereichs.
Der Augeninnendruck ändert sich aufgrund der Open-Globe-Verletzung und der therapeutischen Intervention. Nach der Induktion der Open-Globe-Verletzung nahm der Druck signifikant ab und blieb niedrig, bis das Experiment abgeschlossen war. Die Behandlung der verletzten Gewebe mit Dermabond-Klebstoff führte zu einem erhöhten Augeninnendruck im Vergleich zu unbehandeltem Gewebe, was darauf hindeutet, dass diese Methode verwendet werden kann, um die Wirksamkeit der Therapeutika zur Wiederherstellung des Augeninnendrucks zu messen.
Der anfängliche Aufbau des Segments in der Organkultur ist entscheidend für die Langzeitstabilität des Gewebes. Ein übermäßiges Anziehen des Rings kann zu einer Belastung des Gewebes führen und die Compliance verringern.
