Unser Protokoll bietet uns die Möglichkeit, antibiotikaresistente Bakterien in einer ernährungsphysiologischen und physischen Umgebung zu untersuchen, ähnlich wie sie wahrscheinlich in vivo existieren. Einer der größten Vorteile dieser Technik ist die Möglichkeit, hochauflösende Bilder und phänotypische Daten von Bakterien in infektionsrelevanten Populationsgrößen zu erfassen. Das sind Aggregate von etwa 10 bis 1.000 Zellen.
Demonstriert wird das Verfahren von Alexa Gannon, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor. Zu beginnst du das mucinhaltige Medium unter ultraviolettem Licht vier Stunden lang sterilisieren. Das UV-behandelte Mucin unter sterilen Bedingungen in sterile 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen und bei minus 20 Grad Celsius lagern.
Nachdem Sie die gepufferte Basis vorbereitet haben, fügen Sie die Stammlösung von Mucin in die gepufferte Base ein, die DNA enthält, wie im Textmanuskript beschrieben. Am Abend vor dem Experiment impfen Sie fünf Milliliter LB-Brühe mit mehreren Kolonien von Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 aus einer antibiotischen LB-Agarplatte und kultivieren Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Rührung bei 250 Umdrehungen pro Minute. Schalten Sie am nächsten Morgen, mindestens zwei Stunden vor Beginn des Experiments, das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein und öffnen Sie das Inkubationsmodul in der zugehörigen Bildgebungssoftware.
500 Mikroliter der Kultur in fünf Millilitern frischer LB-Brühe verdünnen und die Bakteriensuspension bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute für 60 bis 90 Minuten inkubieren. Wenn die Bakterien in die Log-Phase eingetreten sind, pelletieren Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation und waschen Sie die Zellen dreimal mit filtersterilisiertem PBS. Nach der letzten Wäsche das Pellet in einem Milliliter PBS wieder auffüllen.
Messen Sie die Absorption der bakteriellen Zellsuspension bei 600 Nanometern, um das Kulturvolumen zu bestimmen, das für eine optische Dichte von 0,05 in fünf Millilitern synthetischer Mukoviszidose-Sputummedium zwei erforderlich ist. Impfen Sie das berechnete Volumen der bakteriellen Zellsuspension im Medium und Wirbel vorsichtig, bevor Sie ein Milliliter Zellen in jede Kammer einer vierkammerigen optischen Kulturschale geben, und inkubieren Sie die Bakterien dann vier Stunden lang unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius. Um die Pseudomonas aeruginosa-Aggregate mit dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop abbilden zu können, bezeichnen Sie am Ende der Inkubation drei Vertiefungen der Kulturplatte als Antibiotika-Behandlungs-Replikate und eine sowie die No-Treatment-Kontrolle und legen Sie die Platte auf die beheizte Stufe im Mikroskop.
Wählen Sie ein 63-faches Ölimmersionsziel und öffnen Sie die Registerkarte "Suchen", um die bakteriellen Aggregate im Hellfeld zu identifizieren. Definieren Sie einen Bereich für die Bildgebung innerhalb jedes Bohrplatzes und verwenden Sie das Positionsmodul, um die Bereichsposition zu speichern. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 488 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 509 Nanometer ein.
Wählen Sie im Aufnahmemodul die Option Z-Stack aus, um die Bilder zu erfassen, und verwenden Sie das Linienmittelungsmodul, um die Hintergrundfluoreszenz im GFP-Kanal innerhalb des Gesamtvolumens der Z-Stack-Bilder zu reduzieren. Legen Sie die Zeitreihenoption so fest, dass 60 Scheiben in jeder Vertiefung in 15-Minuten-Intervallen für 18 Stunden erfasst werden, und verwenden Sie die definitive Fokusstrategie, um eine Fokusebene für jede Position zu speichern, die zu jedem Zeitpunkt während des Experiments neu abgebildet wird. 4-1/2 Stunden nach der Einrichtung des bildgebungsexperiments, stellen Sie jede Position ab, um die aggregierte Biomasse in jeder der vier Vertiefungen vor der Zugabe des Antibiotikums zu bestimmen.
Nach sechs Stunden fügen Sie vorsichtig ein Antibiotikum zu zwei Malen unter der minimalen hemmenden Konzentration in die Mitte jedes Bohrplatzes hinzu, blasen Sie einfach die Luftflüssigkeitsschnittstelle und klicken Sie auf Experiment starten, um die Bildgebung der postantibiotischen Behandlung zu beginnen. Um die lebenden Zellen zu isolieren, kennzeichnen Sie am Ende der 18-stündigen Bildgebungsphase die Bakterien in jedem Brunnen mit dem entsprechenden Volumen an Propidieniodid gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Verwenden Sie am Ende der Inkubation einen isolierten Behälter, um die Platte auf das Durchflusszytometer zu übertragen, und stellen Sie das Zytometer so ein, dass GFP und Propidiodid mit einer 70-Mikron-Düse detektiert werden, und führen Sie dann einen Milliliter Aliquoten jedes Kulturüberstands mit der niedrigsten Durchflussrate aus, um die lebensfähigen GFP-positiven und nicht lebensfähigen Propidieniodid-negativen Pseudomonas aeruginosa-Aggregate zu sortieren.
Um die aggregierte Dynamik zu quantifizieren, laden Sie die Bilder in ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm und erstellen Histogramme der Zählungen, die für die unbehandelten Kontroll- und Antibiotika-behandelten Kulturen im GFP-Kanal erzeugt wurden, um die Quantifizierung der Hintergrundfluoreszenz zu ermöglichen. Um sicherzustellen, dass die nachgewiesenen GFP-Voxel mit der bakteriellen Biomasse korrelieren, definieren Sie einen GFP-positiven Voxel als größer oder gleich dem 1,5-fachen des GFP-Hintergrundzählwerts. Erzeugen Sie die ISO-Flächen für alle verbleibenden Voxel und um einzelne Aggregate zu erkennen, aktivieren Sie die Option Split Objects und definieren Sie die Aggregate als Objekte.
Verwenden Sie das Vantage-Modul, um das Volumen XYZ und die Summe der GFP-Voxel für jedes einzelne Objekt zu berechnen. Exportieren Sie diese Daten auf eine externe Statistikplattform. Filtern Sie die exportierten Daten nach Größe, um Objekte mit Volumina von mindestens fünf Kubikmikrometern zu definieren.
Entfernen Sie alle Objekte mit weniger als 0,5 Kubikmikrometern und verwenden Sie das Sichtmodul, um die Entfernung jedes Objekts in Bezug auf andere Objekte in jedem Bild zu berechnen. Alternativ kann die Entfernung mit der Formel berechnet werden, dann verwenden Sie die Summen- und Durchschnittsberechnungen, um die Gesamtbiomasse im durchschnittlichen Aggregatvolumen zu bestimmen. Obwohl nach vier Stunden Antibiotikaanwendung mehrere lebensfähige Bakterienaggregate verbleiben, ist die Gesamtbiomasse der aggregierten Populationen innerhalb der mit Antibiotika behandelten Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kulturen signifikant reduziert.
Mit der Zeitreihenmikroskopie können die räumlichen Muster zwischen empfindlichen Propidieniodid-positiven und toleranten GFP-positiven Aggregaten nach antibiotikaartiger Behandlung bestimmt werden. Durch die Berechnung, wie Aggregate unterschiedlicher Größe zur Gesamtpopulation beitragen, können Muster identifiziert werden, wie Aggregate auf die Antibiotikabehandlung in Bezug auf ihre Größe, Form und Position reagieren. Nach einer Antibiotikabehandlung können lebensfähige und nicht lebensfähige Aggregate erfolgreich nach ihrer fluoreszierenden Signalexpression getrennt werden.
Wir hoffen, dass dieses Protokoll andere Forscher dazu inspiriert, ihren Organismus der Wahl mit einer ähnlichen Auflösung zu untersuchen. Unser Ziel ist es, in diesen komplexen Gemeinschaften unabhängig von der Infektionsstelle gemeinsame biologische Fäden zu finden.
