Die Entwicklung neuartiger Therapien für ZNS-Metastasen wurde durch den Mangel an guten präklinischen Modellen behindert. Unsere patientenabgeleiteten Xenograft-Modelle rekapitulieren ZNS-Metastasen besser als historisch verwendete Zelllinienmodelle. Durch die Verwendung verschiedener Wege der Tumorinokulation können Sie verschiedene Aspekte der metastasierten Kaskade untersuchen.
Jede Route hat Vorteile, die Sie für Ihr Studium nutzen können. Das Verfahren wird von Ben Yi Tew, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Für die subkutane Flankenimplantation von kryokonservierten PDX-Tumoren wird das kryokonservierte Tumorgewebe in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schnell aufgetaut.
Spülen Sie es dann in fünf Millilitern DPBS in einer Gewebekulturschale ab. Nachdem Sie die Anästhesie bei einer drei bis acht Wochen alten weiblichen NOG-Maus bestätigt haben, machen Sie einen 0,5 bis einen Zentimeter großen Schnitt entweder an der linken oder rechten Flanke und führen Sie ein 2 x 2 x 2 Millimeter großes Stück des Tumorgewebes tief in die Tasche ein. Lassen Sie die Maus nach dem Schließen des Schnitts von der Narkose unter Überwachung erholen, bis sie gehfähig ist.
Sobald der Tumor zu wachsen beginnt, messen Sie den Tumor dreimal pro Woche mit einem Messschieber. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt Metastasen durch eine Nekropsie identifizieren und das Vorhandensein von Tumoren im Zielorgan durch eine histologische Analyse bestätigen. Legen Sie den resezierten PDX-Tumor in DMEM auf Eis.
Waschen Sie den Tumor in fünf Millilitern DPBS in einer Gewebekulturschale und entfernen Sie die nekrotischen Regionen, falls vorhanden. Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke von zwei bis vier Millimetern Länge und geben Sie die Stücke in ein Röhrchen mit Dissoziationslösung. Mit dem entsprechenden Programm auf einem Dissoziator das Gewebe mechanisch dissoziieren und die resultierende Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb abseihen.
Verwenden Sie 20 Milliliter DMEM, um die verbleibenden Zellen aus dem Sieb zu waschen und die dissoziierte Zellsuspension zu zentrifugieren. Dann resuspendieren Sie die Zellen und DPBS zum Zählen und stellen Sie die Zellen auf eine Konzentration von fünf bis 10 mal 10 bis vierten Zellen pro ein bis zwei Mikroliter DPBS ein. Um den Operationsbereich vorzubereiten, rasieren Sie das Fell auf dem Kopf der Maus, um die Kopfhaut freizulegen.
Platzieren Sie dann die Maus in einem stereotaktischen Rahmen und befestigen Sie den Kopf der Maus mit Ohrbügeln. Stellen Sie sicher, dass Sie auch ein geeignetes Analgetikum verabreichen. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Peelings aus Povidon-Jod und 70%igem Ethanol.
Machen Sie einen fünf bis sieben Millimeter langen Längsschnitt, um den Schädel freizulegen und die Kopfhaut zurückzuziehen. Kratzen Sie die Knochenhaut mit einer Pinzette ab, um das Bregma zu lokalisieren. Positionieren Sie die Nadel des stereotaktischen Rahmens auf dem Bregma und setzen Sie die Koordinaten auf Null zurück.
Bewegen Sie den Arm einen Millimeter nach hinten und einen Millimeter seitlich nach rechts von der Mittellinie und markieren Sie diese Stelle mit einem Permanentmarker. Bohren Sie dann an der markierten Stelle ein kleines Bohrloch in den Schädel und achten Sie darauf, nicht in das Gehirn zu bohren. Laden Sie fünf Mikroliter 26-Gauge-Hamilton-Spritze mit ein bis zwei Mikrolitern Zellen und befestigen Sie die Spritze am stereotaktischen Arm.
Führen Sie die Nadel langsam zwei Millimeter in das Gehirn ein und beginnen Sie, Zellen mit der gewünschten Geschwindigkeit zu injizieren. Wenn alle Zellen abgegeben wurden, ziehen Sie die Nadel langsam zurück, füllen Sie das Bohrloch mit Knochenwachs und schließen Sie den Einschnitt. Setzen Sie die Maus zurück in ihren Käfig und überwachen Sie, bis sie sich von der Narkose erholt hat.
Nachdem das Tier am entsprechenden experimentellen Endpunkt eingeschläfert wurde, wird das Vorhandensein von Tumoren im Gehirn durch eine histologische Analyse bestätigt. Um PDX-Tumore durch intrakardiale Injektion zu implantieren, bereiten Sie die Tumorzellen wie gezeigt vor und platzieren Sie die anästhesierte Empfängermaus in Rückenlage. Rasieren Sie das Fell auf der Brust des Tieres und desinfizieren Sie die freiliegende Haut mit Povidon-Jod und 70%igem Ethanol.
Ziehen Sie 0,5 bis 10 mal 10 bis fünfte Tumorzellen und bis zu 100 Mikroliter DPBS in eine Spritze, die mit einer 28-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Lokalisieren Sie die Injektionsstelle etwas links vom Brustbein auf halbem Weg zwischen der sternalen Kerbe und dem Processus xiphoideus. Führen Sie dann die Nadel an der Injektionsstelle senkrecht in die Maus ein.
Sobald ein Rückfluss beobachtet wird, der auf ein erfolgreiches Eindringen der Nadel in die linke Herzkammer hinweist, dosieren Sie die Tumorsuspension langsam in die linke Herzkammer, ohne die Nadel zu bewegen. Wenn alle Zellen abgegeben wurden, ziehen Sie die Nadel langsam und vertikal zurück und tragen Sie etwa eine Minute lang ein Stück sterile Gaze auf die Injektionsstelle auf, bis die Blutung aufhört. Lassen Sie die Maus auf einem beheizten Pad mit Überwachung erholen, bis sie gehfähig ist.
Am entsprechenden experimentellen Endpunkt Metastasen durch eine Nekropsie identifizieren und das Vorhandensein von Tumoren im Zielorgan durch eine histologische Analyse bestätigen. Trotz Unterschieden in der Mikroumgebung des Tumors zeigen die PDX-Tumoren ähnliche Morphologien mit Zellen mit kleinen Zellkernen und spärlichem Zytoplasma, unabhängig vom Ort der Implantation. In dieser Analyse führte die intrakardiale Injektion von humanen Melanomzellen zu Metastasen der Tumorzellen in das Mäusegehirn, während die intrakardiale Injektion von hirnmetastasierenden humanen kleinzelligen Lungenkrebstumorzellen zu Metastasen in die Bauchhöhle und Leber der Maus führte.
Diese Protokolle ermöglichen die Einrichtung präklinischer Studien zur Erprobung neuer Behandlungen und Behandlungskombinationen und können bei der Untersuchung biologischer Prozesse und der Metastasierung von Tumoren helfen.
