Dies ist das erste Protokoll, das es ermöglicht, menschliches Brustgewebe ex vivo für längere Zeit am Leben zu erhalten, was die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen menschlichem Brustgewebe und menschlichem Brustkrebs ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass makroskopische Stücke des menschlichen Brustgewebes einschließlich Brustadipozyten, Immunzellen, Gefäßstrukturen, duktalen Strukturen und extrazellulärer Matrix ex vivo am Leben erhalten werden können. Diese Technik hat große Auswirkungen auf mehrere Bereiche der Brustkrebsforschung, einschließlich personalisierter Medizin, pharmazeutischer Entwicklung und der Pathophysiologie der Tumorinitiierung und langsamerer Brustkrebsprozesse wie Fibrose und extrazellulärem Matrixumbau.
Katherine Hebert, eine Tulane-Doktorandin, und Rakesh Gurrala, eine Tulane-Medizinstudentin aus meinem Labor, demonstrieren dieses Verfahren. Zu beginnt die vorbereitete Gelatinelösung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schmelzen. Verwenden Sie eine serologische Pipette mit fünf oder 10 Millilitern, um 2,5 Milliliter dieser Lösung auf jeden Kolben für Vertiefungen einer Sechs-Brunnen-Platte zu dosieren.
Sobald die Gelatine verfestigt ist, bewegen Sie die pNIPAAm-codierten ASC-Platten in die Biosicherheitswerkbank. Legen Sie die Kolben vorsichtig in die Vertiefungen dieser Platten, damit die Gelatine mit den ASCs in Kontakt tritt. Legen Sie eine Metallscheibe auf den Kolben, um ihn zu beschweren, so dass die Gelatine 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in direktem Kontakt mit dem ASC-Blech steht.
Bewegen Sie die Platte mit den Kolben vorsichtig in die sterile Box in der Bio-Sicherheitsbox und legen Sie den Deckel darauf. Bewegen Sie die Box in einen Vier-Grad-Kühlschrank oder stellen Sie den Teller für 30 Minuten auf Eis und einen Eiskübel in die Bio-Sicherheitswerkbank. Waschen Sie das menschliche Brustgewebe in einer Biosicherheitswerkbank dreimal mit 10 Millilitern sterilem PBS.
Verwenden Sie eine sterile Zette und eine Rasierklinge, um das BC-MPS grob zu zerhacken und versuchen Sie, so viel Faszien und Bindegewebe wie möglich zu entfernen. Sobald das Bindegewebe entfernt wurde, verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um das Gewebe schließlich zu zerhacken, bis es eine homogene flüssige Konsistenz hat. Schneiden Sie die Spitze einer P1000-Pipettenspitze ab, um das Pipettieren des gehackten Gewebes zu unterstützen.
Kombinieren Sie in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen das Hackfleischgewebe, die Krebszelllinien und die BC-MPS-Medien, wie im Textmanuskript beschrieben. Bewegen Sie die ACS-Platte, die für die untere Zellplatte verwendet wird, vom Inkubator in die Biosicherheitsschrank und saugen Sie das Medium von der Platte ab. Pipetieren Sie die vorbereitete Brustgewebemischung mit der geschnittenen Pipettenspitze auf die Mitte des Brunnens der unteren ACS-Platte, bewegen Sie die Box mit der oberen ACS-Platte mit Kolben in die Biosicherheitswerkbank.
Entfernen Sie vorsichtig die Gelatinekolben von der pNIPAAm-beschichteten Platte und legen Sie sie auf die Gewebemischung. Fügen Sie BC-MPS-Medien in den Brunnen hinzu und bewegen Sie die unteren ACS-Platten vorsichtig mit der BC-MPS-Mischung und den Kolben in die sterile Kunststoffbox. Legen Sie den Deckel der Box für den Transport auf und achten Sie darauf, eine Kontamination der Kultur zu vermeiden.
Inkubieren Sie die bodenplatte in der Box und den 37 Grad Celsius inkubieren, bis die Gelatine geschmolzen ist und die obere ACS-Schicht begonnen hat, an der unteren Schicht zu haften. Dann bewegen Sie die Box mit den Platten in die Bio-Sicherheitswerkbank, entfernen Sie vorsichtig die Kolben von den Bodenplatten, um das Gewebe mit den Krebszellen zu beobachten, die am Boden des Brunnens verankert sind. Legen Sie den Deckel der Sechs-Well-Platte wieder auf die untere Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad, um die Gelatine vollständig zu schmelzen und die obere Schicht an der unteren Schicht verankern zu lassen.
Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine Biosicherheitswerkbank und saugen Sie das Medium mit einer 10 Milliliter serologischen Pipette vom Rand des Brunnens ab. Fügen Sie zwei Milliliter frisches Medium auf den Rand jedes Brunnens hinzu, um zu vermeiden, dass sich das Gewebe löst. Halten Sie den BC-MPS bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für die gewünschte Zeit.
Medienwechsel alle zwei bis drei Tage. Bewegen Sie die Platte in die Biosicherheitswerkbank, wenn das BC-MPS zur Analyse bereit ist. Entfernen Sie die Medien mit einer serologischen Pipette, um ein versehentliches Entfernen von Gewebe zu vermeiden.
Fügen Sie jedem Bohrbrunnen ein PBS-Volume hinzu. Anschließend das PBS mit einer serologischen Pipette entfernen. Fügen Sie einen Milliliter Zelldissoziationslösung zu jeder Vertiefung hinzu und bewegen Sie die Platte für fünf Minuten zurück zum Inkubator, damit sich diese Zellen lösen können.
Verwenden Sie nach der Inkubation einen Zellschaber, um die Zellen und das Gewebe in einer Biosicherheitswerkbank vollständig von der Kulturplatte zu lösen. Übertragen Sie die Lösung mit dem Gewebe in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen und sammeln Sie alle verbleibenden Zellen durch Zugabe von zwei Millilitern PBS. Wickeln Sie die Tube mit Aluminiumfolie ein, wenn die Zellen fluoreszierend sind.
Inkubieren Sie den Schlauch bei 37 Grad unter ständigem Rühren in einem Orbitalschüttler zu einem Zeitpunkt G für 10 bis 20 Minuten, um die Zellen vollständig vom Gewebe zu dissoziieren. Verwenden Sie in einer Biosicherheitswerkbank eine serologische Pipette, um verbleibende Zellklumpen in der Röhre zu stören. Und filtern Sie die Probe durch ein 250 Mikrometer großes Gewebesieb in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.
Spülen Sie das Sieb mit einem Milliliter PBS ab, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 500 g bei Raumtemperatur, um die Adipozyten, die in der obersten Schicht schwimmen, von den Krebszellen und ASCs zu trennen, die in einem Pellet miteinander vermischt sind. Übertragen Sie die Adipozytenschicht mit einer stumpf geschnittenen Pipettenspitze in ein neues Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Probe erneut und entfernen Sie mit einer Spritze und einer Nadel die verbleibende Lösung unterhalb der Adipozyten. Saugen Sie die verbleibende Lösung aus dem Röhrchen, das die ASCs und Krebszellen enthält, ohne das Zellpellet zu stören. Suspendieren Sie das Pellet in PBS- oder BC-MPS-Medien und verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Zellen basierend auf Fluoreszenz zu sortieren.
Hier ist das stri-gestützte Muster des konfluenten ASC-Blattes dargestellt. Das schwimmende menschliche Brustgewebe war nach 14 Tagen Kultur noch stabil durch die ASC-Zellblätter am Boden des Brunnens verankert. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen die Stabilität des BC-MPS mit MDA-MB-231 exprimierenden RFP-Zelllinien nach 14 Tagen und mit dreifach negativem Tumor explantieren PDX für mindestens sechs Tage.
BC-MPS, das Brustgewebe enthält, wurde 14 Tage lang in vitro kultiviert, gefärbt und abgebildet, um die nativen Elemente des Gewebes bei 100-facher und 20-facher Vergrößerung zu demonstrieren. Die Färbung der Makrophagenmarker wurde verwendet, um die Erhaltung der primären Makrophagen nach drei und sieben Tagen in Kultur zu zeigen. Die Durchflusszytometrie-Analyse von Bodipy-gefärbten MDA-MB-231-Zellen nach 14 Tagen zeigt eine minimale Lipidakkumulation in 2D-Kultur und eine umfangreiche Lipidakkumulation und BC-MPS.
Der Anteil lipidpositiver MDA-MB-231-Zellen war in BC-MPS 26,2-fach höher als in 2D-Kultur. Zellen, die in BC-MPS kultiviert wurden, zeigten einen Anstieg der Lipidtröpfchen im Vergleich zu Zellen, die in Standard-2D-Kultur kultiviert wurden. Zeitrafferbilder von RFP-markierten BC-MPS mit MDA-MB-231-Zellen zeigten eine amöboide Bewegung von 231 Zellen mit Pseudokapseln und hoher Motilität.
Das Brustgewebe muss klein genug gehackt und so weit getrennt werden, dass es über den Boden des Brunnens verteilt werden kann. Brustgewebe ist sehr schwimmfähig und wenn die Stücke zu groß oder zu eng beieinander gruppiert sind, können die ASC-Zellblätter das Brustgewebe nicht am Boden des Brunnens verankern. Die resultierenden Brustkrebskonstrukte können enzymatisch verdauen, um bestimmte Zelltypen von Interesse zu isolieren.
Auf diese Weise können Schlüsselfragen beantwortet werden, z. B. wie Krebszellen im Brustgewebe anders auf Chemotherapie reagieren als herkömmliche 2D-Kultur oder Organoide.
