Name: applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Die Arbeit im Januschke-Labor wird von Wellcome Trust Grants 100031/Z/12/A und 1000032/Z/12/A unterstützt. Die Gewebebildgebungseinrichtung wird durch das Stipendium WT101468 von Wellcome unterstützt.

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G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. 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ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Live-Bildgebung der gesamten Mount D. melanogaster Larvengehirne bietet die Möglichkeit, asymmetrische neuronale Stammzellteilungen in Bedingungen in der Nähe eines physiologischen Kontextes zu beobachten. Der erste Teil unseres Protokolls stellt unseren Ansatz zur Zerlegung von Larvenhirnen vor. Wie bereits erwähnt13, ist ein kritischer Aspekt der Vorbereitung zu vermeiden, das Gehirn zu beschädigen. Die schwierigste Aspekt dieser ist es, das Gehirn von den benachbarten imaginären Scheiben zu trennen, ohne übermäßig auf das Gehirn zu ziehen. Unser Ansatz zum "Schneiden ohne Ziehen" besteht darin, entweder eine Schleifbewegung mit den Spitzen eines Zangenpaares durchzuführen oder eine Zangenspitzen entlang zweier anderer Zangenspitzen zu schieben, die die Verbindung zwischen Geweben halten (Abbildung 1A), während Lerit et al. sägeartige Bewegungen mit einem Trennstift beschreiben. Wir raten dem Experimentator, alle Ansätze auszuprobieren und die am besten geeigneten für sich zu übernehmen. Wir empfehlen auch, BSA- oder FCS-beschichtete Pipettenspitzen anstelle von Sezierwerkzeugen zu verwenden, um isolierte Gehirne zu übertragen. Die Beschichtung verhindert, dass Gewebe am Kunststoff kleben und ermöglicht den sicheren Transfer von Geweben, während sie immer vollständig eingetaucht werden, ohne sie einer möglichen vorübergehenden Verformung zu unterwerfen, da sie während des Transfers am Sezierwerkzeug kleben. Beschichtete Spitzen haben andere Vorteile, um die Übertragung mehrerer Gehirne auf einmal zu ermöglichen, was besonders nützlich ist, wenn es wichtig ist, die Aufenthaltszeit der Proben innerhalb eines bestimmten Mediums zu kontrollieren; sie eignen sich für den Transfer anderer Gewebe, auch zerbrechlicher Gewebe wie z. B. Fettkörper; Sie können eine breite Palette von verschiedenen Probengrößen aufnehmen, indem sie größere Spitzen verwenden oder die Extremität der Spitze schneiden.
Als nächstes beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Fibrinogen-Gerinnung, um Larvengehirne auf dem Deckblatt einer Kulturschale zu immobilisieren. Ein Gehirn ist innerhalb eines Tropfens von Kulturmedium + Fibrinogen ausgerichtet, nach dem die Gerinnung durch die Zugabe von Thrombin induziert wird. Die Fibrin-Bildung erfolgt schrittweise und bietet ein Zeitfenster, in dem die Ausrichtung der Probe gegebenenfalls verfeinert werden kann(Abbildung 2C). Wenn eine leichte Kompression der Probe erforderlich ist - wovon wir bei Larvenhirnen raten -, kann sie auch fein eingestellt werden, indem das Gerinnsel in den Schritten 3.4.4 und 3.5.2 mehr oder weniger nahe an der Probe gedrückt wird. Der Hauptvorteil dieser Fibrinogen-Gerinnung gegenüber dem in Lerit et al. beschriebenen Protokoll, in dem Gehirne zwischen einer gasdurchlässigen Membran und einem Abdeckrutsch montiert sind, ist die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu ersetzen. Ein möglicher Vorteil der Verwendung einer gasdurchlässigen Membran gegenüber unserem Protokoll könnte sein, dass sie eine optimale Sauerstoffversorgung der Proben bietet, die mit unserem Ansatz eingeschränkter sein könnte, da Gehirne durch das Gerinnsel und ein Medium von der Luft getrennt werden. Aus diesem Grund, obwohl wir nicht die Wirkung der Menge der Kulturmedium innerhalb der Kultur Gericht bewertet, schlagen wir vor, die Menge der Kultur Medium auf den Gerinnseln zu begrenzen, während die Gerinnsel vollständig eingetaucht.
Da die Manipulation der Gerinnsel experimentell schwierig und zeitaufwändig sein kann, empfehlen wir dem Experimentator, zunächst Gerinnsel ohne Proben zu manipulieren. Die Modulation des Volumens des Tropfens kulturmittel + Fibrinogen auf dem Deckel, die Konzentration von Fibrinogen oder das Volumen und die Konzentration von Thrombin könnte dazu beitragen, die Vorbereitung zu erleichtern und könnte wichtig sein, wenn das Protokoll an andere Arten von Geweben angepasst werden. Mit genügend Erfahrung bei der Manipulation der Gerinnsel können bei Bedarf mehrere Gehirne in einem Gerinnsel immobilisiert werden, obwohl dies die Feinabstimmung der Ausrichtung erschwert. Auf dem Deckblatt können mehrere Gerinnsel gebildet werden, so dass z.B. Proben verschiedener Genotypen abbilden können. Es ist auch möglich, verschiedene Gerinnsel auf dem gleichen Coverslip verschiedenen Kulturmedien auszusetzen, obwohl darauf geachtet werden muss, niemals die Tropfen des Kulturmediums zu mischen, das die verschiedenen Gerinnsel bedeckt. Sobald Larvengehirne immobilisiert sind und bereit für Live-Bildgebung, empfehlen wir, die Empfehlungen von Lerit et al.13 zu folgen, um übermäßige Photoschäden zu vermeiden. Wir fügen diesen Empfehlungen nur hinzu, um das Gehirn nicht nur bei 25 °C während der Live-Bildgebung mit einem Bühneninkubator zu halten, sondern auch, um dieses Stadium mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung vorzuheizen. Wenn wir dies nicht systematisch tun, führt dies zu einer starken Fokusdrift.
Es kann in einigen Kontexten vorteilhaft sein, korrelierte Mikroskopie durchzuführen und eine Probe nach Live-Bildgebung zu fixieren und zu immunstainieren. Eine Einschränkung der Verwendung von Fibrin-Gerinnseln ist jedoch, dass es fast unmöglich ist, ein Gehirn mechanisch von einem Gerinnsel zu isolieren, ohne es zu beschädigen. Ein möglicher Weg, diese Einschränkung zu überwinden, könnte darin bestehen, Methoden zu entwickeln, um Fibrin-Gerinnsel mit Plasmin zu abbauen oder die Gerinnseldemontage durch Zugabe eines Peptids zu induzieren, das die Knöpfe imitiert, was die Fibrin-Polymerisationermöglicht 28. Wir verwenden in der Regel Fibrin-Gerinnsel auf Proben von Einzelzellen bis zu 200 M langen Geweben, aber wir könnten auch erfolgreich in Gerinnseln und Bildgehirnen von erwachsenen Hummeln über 3 mm Breit immobilisieren. Die Obergrenze des Stichprobenumfangs, der in Gerinnsel immobilisiert werden kann, muss noch ermittelt werden. In ähnlicher Weise, obwohl wir in der Regel immobilisierte Proben für 4 bis 5 h abbilden, haben wir neuroblasten in der Primärkultur für bis zu 3 Tage erfolgreich ababgebildet, was darauf hindeutet, dass das Gerinnsel zumindest die längerfristige Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt. Im Gegenteil, Gerinnsel können den regelmäßigen Austausch des Mediums erleichtern, eine Voraussetzung für eine längerfristige Bildgebung, ohne dass geräte wie peristaltische Pumpen für diesen Zweck benötigt werden. Während wir die Permeabilitätsparameter von Fibringer nicht gemessen haben, scheint die faserige gelartige Natur der Gerinnsel durch zelldurchlässige Moleküle durchdrungen zu sein. Wir fanden heraus, dass Latrunculin A, Colcemid oder 1-NAPP1, HALO-Tag Liganden und andere Standardfarbstoffe, die in der Zellbiologie verwendet werden, die Zellen im Fibringer problemlos erreichen und bisher keine Moleküle gefunden haben, die durch das Gerinnsel zurückgehalten würden, was jedoch eine Möglichkeit ist, die empirisch getestet werden muss.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung von Fibrin-Gerinnseln eine zuverlässige und relativ einfache Implementierung einer Möglichkeit bietet, lebende Gewebe für die Live-Bildgebung zu immobilisieren. Über seine Nützlichkeit bei der Begrenzung des seitlichen Driftens hinaus hat sich die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu verändern, als von unschätzbarem Wert für unseren ansatzbereiten Ansatz der chemischen Genetik erwiesen, die asymmetrische Zellteilung von D. melanogaster Neuroblasten zu untersuchen21. Wir gehen davon aus, dass diese Technik für Studien in einer Vielzahl unterschiedlicher Gewebe von Vorteil sein wird, insbesondere wenn sie chemische Genetik oder beispielsweise die Protein-Selbstkennzeichnung29beinhalten.
Unser MultiHyperStackReg-Makro basiert auf dem TurboReg ImageJ-Plugin, das aufeinander folgende Frames oder Slices eines Stacks ausrichtet, und dem MultiStackReg ImageJ-Plugin, das es ermöglicht, die Transformationen auf andere Stacks anzuwenden. MultiHyperStackReg ermöglicht es einfach, diese Transformationen auf Hyperstacks anzuwenden (Stapel mit mindestens vier Dimensionen). Da die Verwendung von MultiHyperStackReg, wie wir es beschreiben, viele Aktionen erfordert und ziemlich zeitaufwändig werden kann, haben wir auch das AutoHyperStackReg-Makro geschrieben, das automatisch alle in den Schritten 6.2 und 6.3 beschriebenen Schritte ausführt. Im Gegensatz zu MultiHyperStackReg fehlt AutoHyperStackReg derzeit jedoch die Möglichkeit, die Ausrichtung eines Stacks basierend auf einer Subregion dieses Stacks zu berechnen, eine Option, die wir gefunden haben, ist manchmal entscheidend für eine befriedigende Ausrichtung. Eine weitere Einschränkung von AutoHyperStackReg besteht darin, dass seine Verwendung auf Übersetzungen beschränkt ist und nicht auf die anderen Transformationen, die von TurboReg und MultiStackReg vorgeschlagen werden, während MultiHyperStackReg auf einen Hyperstack jeden Transformationstyp anwenden kann, wenn der Benutzer ihn benötigt. Zukünftige Versionen werden diese Funktionen implementieren und auf GitHub30verfügbar sein. Schließlich bietet unser rotierendes Linecan-Makro eine einfache Möglichkeit, kortikale Signale im Zeitraffer schnell zu messen, auch wenn der Kortex seine Position oder Ausrichtung im Laufe der Zeit ändert. Ob der Tracking-Modus oder der Nicht-Tracking-Modus für die Analyse am besten geeignet ist, hängt von der Qualität und Konsistenz des kortikalen Signals ab. Der Tracking-Modus ist einfacher zu verwenden, da der Benutzer nicht berücksichtigen muss, wo sich der Kortex für jeden Zeitpunkt befindet und große Positions- und Orientierungsänderungen im Laufe der Zeit aufnehmen kann. Es ist jedoch nur dann geeignet, wenn das kortikale Signal während des gesamten Films stark genug bleibt, um es zu detektieren: Ein Versäumnis, etwas anderes als den Kortex zu erkennen (z. B. ein helles zytoplasmatisches Fach in der Nähe des Kortex), kann die Detektion für jeden folgenden Zeitpunkt beeinträchtigen (z. B. bewegt sich das zytoplasmatische Fach vom Kortex weg und die kortikalen Linien können ihm für den Rest des Zeitraffers folgen). Der Nicht-Tracking-Modus hat diese Falle nicht, da die Erkennung auf die ursprünglich vom Benutzer gezeichnete Linie beschränkt ist (z. B. kann ein helles zytoplasmatisches Fach dazu führen, dass die Erkennung für einige Zeitpunkte fehlschlägt, aber da sich das zytoplasmatische Fach von der Detektionszone entfernt, wird die korrekte Erkennung des Kortex fortgesetzt), verhält sich aber nicht gut, wenn sich die Kortexposition oder -ausrichtung im Laufe der Zeit stark ändert. Das nächste Feature (das auf GitHub30verfügbar sein wird), das für den Tracking-Modus entwickelt werden soll, ist die Option, nur bestimmte Zeitpunkte zu analysieren und einen Referenzzeitpunkt (anstelle des ersten Zeitpunkts) zu definieren, vor dem und nach dem die Erkennung durchgeführt wird, wodurch der Benutzer zumindest problematische Zeitpunkte vermeiden kann.

Drosophila ist nach wie vor ein wichtiges Modellsystem, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu untersuchen und hat sich seit Jahrzehnten in der Weiterentwicklung von Wissen in vielen Disziplinen hervorgetan. Ein Merkmal, das es besonders auszeichnet, ist, dass es besonders gut für Live-Bildgebung geeignet ist. Die Fähigkeit, subzelluläre Prozesse oder das Verhalten von Zellen und Geweben in Echtzeit zu überwachen, trägt weiterhin zur Generierung von Schlüsselkonzepten bei, die für die Zell- und Entwicklungsbiologie relevant sind. Viele erfolgreiche Protokolle wurden von verschiedenen Gruppen entwickelt, um solche Drosophila-Proben lebendig und gesund zu halten, um das Verhalten der Probe und der fluoreszierenden Moleküle zu studieren. Organe und Gewebe aus der Fliege wie imaginäre Scheiben1,2, das Larvenhirn3,4,5,6, oder Eikammern von erwachsenen Weibchen7,8,9, oder der adulte Darm10 zum Beispiel kann extrahiert und in Kultur für die Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden. Eine zentrale Herausforderung für die Live-Bildgebung besteht darin, sicherzustellen, dass die Probe für eine optimale Auflösung und unbeweglich in der Nähe der Bildfläche gehalten wird, ohne die Probenintegrität zu beeinträchtigen, die empfindlich auf mechanische Stöße reagieren kann. Um neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten oder Neuronen im Drosophila Larvenhirn, zu untersuchen, kann beispielsweise die Aufbewahrung von Proben in der Nähe der bildgebenden Oberfläche erreicht werden, indem man sie mit Kulturmedien in versiegelten Bildkammern11,12,13bedeckt. Dieser Ansatz lässt den Medienaustausch jedoch nicht so einfach zu und schränkt so den versuchsfreudigen Handlungsspielraum ein. Alternativ können Proben vorbereitet und auf Abdeckungen platziert werden, die behandelt werden, um die Haftung von Zellen zu erhöhen und Multi-Point-Besuchsmikroskopie und erweiterte Live-Zell-Bildgebung in offenen Kulturgerichten zu ermöglichen, die potenziell einen Medienaustausch ermöglichen, aber keine einfachen Mittel bieten, um Probendrift oder Verlust während des Medienaustauschs zu verhindern14,15.
Die Fibrin-Gerinnselmethode, die ursprünglich entwickelt wurde, um Meiose in lebenden Kranich-Fliegen-Spermatozyten16 zu untersuchen, ist speziell geeignet, um diese Probleme zu überwinden. Fibrinogen wird in einem relevanten Kulturmedium gelöst, die Proben, die in einem Tropfen dieser Lösung auf einer geeigneten Glas-Oberflächen-Bildkammer platziert und ausgerichtet sind, bevor Thrombin hinzugefügt wird, was zur schnellen Bildung eines unlöslichen Fibrin-Gerinnsels führt, eines klebrigen faserigen Netzes, das an der Glasoberfläche und den Proben haftet und gleichzeitig den Zugang der Probe zum Kulturmedium gewährleistet. Das Medium kann dann ausgetauscht werden, ohne die Gerinnsel- oder Probenposition zu stören. Der Austausch von Kulturmedien während der Bildgebung ist beispielsweise wünschenswert, wenn Inhibitoren wie bei der ursprünglichen Methode oder zum Auswaschen oder Pulsjagdexperimenten zugesetzt werden sollen oder wenn fluoreszierende Farbstoffe während der Livezellbildgebung zugesetzt werden sollen, während Zellen und Gewebe an Ort und Stelle gehalten werden. Fibrin-Gerinnsel eignen sich zur Abbildung von Drosophila-Geweben sowie einzelnen Zellen13,17. Fibrin-Gerinnsel können weiter verwendet werden, um Proben zu orientieren, die aufgrund ihrer Form oder anderer Eigenschaften normalerweise nicht in der gewünschten Weise durch Modulation der Probenposition innerhalb des Fibrin-Gerinnsels und der Form des Gerinnsels selbst ausgerichtet würden.
Hier stellen wir ein Update zu unseren aktuellen Fibrin Gerinnsel-basierten Bildgebungsmethoden zur Verfügung und stellen Werkzeuge für die segmentierungsbasierte Bildanalyse zur Verfügung und konzentrieren uns auf den Einsatz dieser Methode zur Untersuchung von Neuroblastenteilungen im sich entwickelnden Fliegenhirn. Wir verwenden routinemäßig die Fibrin Gerinnsel-Methode, um mehrere Proben in verschiedenen Gerinnseln in der gleichen Kulturschale zu folgen. Dies ermöglicht i) Die Bildgebung subzellulärer Ereignisse wie Zentromomverhalten oder mRNA-Lokalisierung live18,19, ii) Überwachung des Verhaltens von Proben bei der pharmakologischen Behandlung verschiedener Genotypen unter den gleichen bildgebenden Einstellungen mit Multipunkt-Besuchsmikroskopie20, iii) Untersuchung der Auswirkungen der akuten Hemmung der Enzyme21 und iv) Minimierung von Driften zur Untersuchung von Veränderungen in der Ausrichtung der Zellteilung von Zellen in ihrer physiologischen Umgebung auf gezielte Laser-Abl2. Während unerwünschte Wirkungen von Thrombin und Fibrinogen und dem Fibrin-Gerinnsel empirisch für jede Probe getestet werden müssen, Diese Methode ist grundsätzlich geeignet, jede Art von Probe zu immobilisieren, die durch Live-Zell-Bildgebung analysiert werden soll und in Drosophila wurde erfolgreich verwendet, um mehrere Aspekte der Neuroblasten Biologie5,19,20, sondern auch die Dynamik der zytosensorischen Projektionen der weiblichen Keimbahn Stammzellen23 und Veränderungen der Polarität bei akuter aPKC Hemmung der Follikelzellen von Drosophila weiblichen Eikammern21zu studieren.
Zeitrafferfluoreszenz-Bildgebung führt zur Generierung komplexer zeitaufgelöster 3D-Datensätze, die Methoden zum Extrahieren dieser quantitativen Informationen erfordern. Hier beschreiben wir unsere Weiterentwicklung von ImageJ-basierten24 Makros, die verwendet werden können, um das Driften in Hyperstacks und maßgeschneiderten ImageJ-Makros zu korrigieren, die eine halbautomatische Quantifizierung der Mehrkanalfluoreszenz am Zellkortex ermöglichen, die zur Quantifizierung kortikaler Proteine in Neuroblasten von Drosophila-Larval-Gehirnen oder von individuellen Strahlneuronen in der primären Zellkultur entwickelt wurde.

<table><tbody><tr><td>Albumin bovine serum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from human plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex spot plate with nine depressions</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila ist ein wichtiges Modellsystem, um eine Breite von biologischen Fragen zu studieren. Verschiedene Organe und Gewebe aus verschiedenen Entwicklungsstadien der Fliege wie imaginäre Scheiben, das Larvenhirn oder Eikammern von erwachsenen Weibchen oder der adulte Darm können extrahiert und in Kultur zur Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden, was wertvolle Einblicke in die Zell- und Entwicklungsbiologie bietet. Hier beschreiben wir detailliert unser aktuelles Protokoll zur Zerlegung von Drosophila Larvenhirnen und stellen dann unseren aktuellen Ansatz zur Immobilisierung und Orientierung von Larvenhirnen und anderen Geweben auf einem Glasdeckel mit Fibrin-Gerinnseln vor. Diese Immobilisierungsmethode erfordert nur die Zugabe von Fibrinogen und Thrombin zum Kulturmedium. Es eignet sich für hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung an invertierten Mikroskopen mehrerer Proben in derselben Kulturschale, minimiert das seitliche Driften, das häufig durch Bewegungen der Mikroskopstufe in der Multipoint-Besuchsmikroskopie verursacht wird, und ermöglicht das Hinzufügen und Entfernen von Reagenzien während der Bildgebung. Wir präsentieren auch maßgeschneiderte Makros, die wir routinemäßig verwenden, um sie beim Driften zu korrigieren und spezifische quantitative Informationen aus der Zeitrafferanalyse zu extrahieren und zu verarbeiten.

Immobilisierung von Drosophila Gewebe mit Fibrin Gerinnseln und Kultur Medium Austausch während der Live-Bildgebung. Nach der Zerlegung nach dem in Schritt 2 (Abbildung 1) vorgestellten Verfahren und immobilisierten Fibrin-Gerinnsel auf demselben Deckzettel nach dem in Schritt 3 (Abbildung 2) vorgestellten Verfahren wurden Larvenhirne, die GFP-markierte Bazooka (Baz::GFP) exdrücken, der Fliegenortholog des Polaritätsproteins Par-3 3 30 min in zeitrafferiger multilinker konfokaler Bildgebung abgebildet. Baz::GFP wird mit apkcas4kombiniert, einem Allel, das eine akute Hemmung der atypischen Proteinkinase C (aPKC) durch Zugabe des kleinen ATP-Analogs 1-NAPP120ermöglicht. 1-NAPP1 wurde daher nach dem in Schritt 4 vorgestellten Verfahren dem Kulturmedium hinzugefügt und die Live-Bildgebung für 2,5 h wieder aufgenommen. Kontrollgehirne, die eine wilde Version der Kinase aPKC trugen, reagierten nicht auf das ATP-Analog, während Gehirne, die zusätzlich eine analog-empfindliche Mutation von aPKC (apkcas4) trugen, eine Kontraktion des Neuroepithels und helle Cluster von Baz in Neuroblasten und deren Nachkommen zeigten ( Abbildung6, Video 1). Neuroblasten teilen sich während des Zeitraffers weiter, was darauf hindeutet, dass das Gewebe gesund bleibt, und das Gehirn zeigt trotz des Kulturmediumwechsels wenig Drift, was darauf hindeutet, dass sie gut immobilisiert sind. In ähnlicher Weise wurden nach der Seziertheit nach dem in27vorgestellten Verfahren Ovariole, die Baz::GFP ausdrückend in Fibrin-Gerinnseln auf demselben Deckzettel immobilisiert und für 8 min abgebildet wurden, woraufdurch die Anwendung von 1-NAPP1 die Kontraktion von apkcas4 mutierten Follikelzellen, aber nicht von Kontrollen induzierte (Abbildung 7, Video 2).
Korrektur der Seiten- und Fokusdrift mit MultiHyperstackReg. Ein Hyperstack, der sowohl die Seiten- als auch die Fokusdrift(Video 3, linkes Panel) anzeigt, wurde zuerst für die seitliche Drift korrigiert (Schritt 6.2, Abbildung 3, MittleresPanel), dann Fokusdrift (Schritt 6.3, Abbildung 4, Video 3, rechtes Panel) mit dem MultiStackReg-Plugin und dem MultiHyperstackReg-Makro, was zu einer erheblichen Reduzierung der im ursprünglichen Hyperstack beobachteten Bewegungen führt.
Kortikale Signalmessung mit rotierenden Linecans Ein Neuroblast, der Baz ausdrückt::GFP (grün) und das Transmembranprotein CD4, das mit einem Infrarotfluoreszenzprotein (CD4::mIFP, rot) markiert ist, wurde während einer Mitose abgebildet. Das CD4::mIFP-Signal wurde als Referenz verwendet, um den Kortex an verschiedenen Teilen des Neuroblasts mit Linescans zu erkennen (Schritt 7, Abbildung 5, Abbildung 8A–C) und das Baz::GFP-Signal wurde an den erkannten Positionen gemessen Abbildung 8D). Während ihrer Teilung polarisierten Neuroblasten vorübergehend, indem sie unterschiedliche und entgegengesetzte kortikale Domänen aufstellen: den apikalen Pol und den Basalpol. Baz definiert den apikalen Pol und konsequent das Baz::GFP-Signal am apikalen Pol des Neuroblasten und verringerte sich während der Teilung am Basalpol (Abbildung 8C,D). Die Position des Kortex wurde während des gesamten Zeitraffers zufriedenstellend nachverfolgt (Abbildung 8C, Video 4). Die Drosophila-Linien und Genotypen werden in der Zusatztabelle 1–2referenziert.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Abbildung 6: Anwendung eines ATP-Analogs auf immobilisierte Larvengehirne während der Live-Bildgebung. (A) Live-Bildgebung von zwei Larvengehirnen, die Baz exexzessiver exallert::GFP auf demselben Deckzettel immobilisiert. Das Kulturmedium wird bei 0 min auf eine Konzentration von 10 m des ATP-Analogs 1-NAPP1 umgestellt. Kontrollgehirne reagieren nicht sichtbar auf das ATP-Analog, während Gehirne, die eine analogempfindliche Mutation von aPKC (aPKCAS4) tragen, eine Kontraktion des Neuroepithels (Pfeilspitzen) und helle Ballhaufen von Baz in Neuroblasten und ihrer Nachkommen zeigen. Maximale Intensitätsprojektion von 33 Scheiben für eine Tiefe von 23 m. Skalenbalken: 20 M. (B) Vergrößerung des Neuroepithels. Maßstabsleiste: 10 M. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Abbildung 7: Anwendung eines ATP-Analogs auf immobilisierten Eikammern während der Live-Bildgebung. Live-Bildgebung von zwei Ovariolen, die Baz exzessiieren::GFP auf dem gleichen Deckschein immobilisiert. Das Kulturmedium wird bei 0 min auf eine Konzentration von 10 m des ATP-Analogs 1-NAPP1 umgestellt. Kontrolleierkammern reagieren nicht sichtbar auf das ATP-Analog, während Eikammern, die eine analogempfindliche Mutation von aPKC (aPKCAS4) tragen, eine Kontraktion des Epithels (Pfeilspitzen) zeigen, was schließlich zum scheinbaren Abbau von Haftknotenführt führt. Maximale Intensitätsprojektion von 33 Scheiben für eine Tiefe von 27 m. Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Abbildung 8: Messung des kortikalen Signals mit rotierenden Linecans. (A) Live D. melanogaster neuroblast expressing Baz::GFP (grün) und CD4::mIFP (rot). Cyan-Linien: anfängliche Scanlinien, die senkrecht zu verschiedenen kortikalen Zonen verfolgt werden, um sie zu messen. Maßstabsleiste: 5 m. (B) Identifikation des Kortex (dunkelblaue Linie) mit kortikalen Linien und CD4::mIFP (rot) als Referenzkanal. Cyan-Linie: Fläche, die durch den Parameter "Ummessen" definiert wird (hier 2 Pixel), wobei das Signal nach der Kortexerkennung gemessen wird. Skala bar: 2 m. (C) Cyan: kortikale Bereiche, die während einer Neuroblastenteilung durch die rotierende Linecans-Methode aus den anfänglichen Scanlinien identifiziert werden, die in (A) angezeigt werden, mit CD4::mIFP (rot) als Referenzkanal. Maßstabsleiste: 5 m. Pfeil: apikaler Pol. Pfeilspitze: Basalpol. (D) Messung der Baz::GFP-Signalintensität im Zeitverlauf in den beiden entsprechenden Zonen, die durch rotierende Linien in (C )identifiziert werden. Während der Mitose, Baz::GFP wird vorübergehend an der apikalen Pol des Neuroblasten angereichert und wird vom gegenüberliegenden Basalpol erschöpft. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Video 1: Anwendung des Medienaustauschs auf immobilisierte Larvengehirne während der Live-Bildgebung, um einen Inhibitor hinzuzufügen, dargestellt in Abbildung 6,Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 2: Anwendung des Medienaustauschs auf immobilisierten Eikammern während der Live-Bildgebung, um einen Inhibitor hinzuzufügen, dargestellt in Abbildung 7,Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 3: Korrektur von Seiten- und Fokusdrift mit MultiHyperStackReg. Live-Bildgebung eines Neuroblasten, der die Membransonde PH::GFP exzessither ausdrückt. Xy: einzelne Fokusebene. Xz: orthogonales Reslice. Links: vor Korrektur der Drift. Mitte: nach Korrektur der seitenseitigen Drift. Rechts: nach Korrektur die Seiten- und Fokusdrift, Skalenleiste: 10 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 4: Erkennung des Kortex mit rotierenden Linien, dargestellt in Abbildung 8, Maßstabsleiste: 5 m. Bitte klicken Sie <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Genotypen von abgebildeten Drosophila Gewebe. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 1: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 2: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 3: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Dieses Protokoll beschreibt Anwendungen der Probenimmobilisierung mit Fibrin-Gerinnseln, die Begrenzung des Driftens und das Hinzufügen und Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung. Die Proben werden auf einen Tropfen Fibrinogen übertragen, der das Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckslips enthält, nach dem die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird.

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Aufrufe.  University of Dundee. Dieses Protokoll beschreibt Anwendungen der Probenimmobilisierung mit Fibrin-Gerinnseln, die Begrenzung des Driftens und das Hinzufügen und Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung. Die Proben werden auf einen Tropfen Fibrinogen übertragen, der das Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckslips enthält, nach dem die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird.

Serie: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Forschung

Biotechnik

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neurowissenschaften

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in

LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Zusammenfassung

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Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in

LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in