Die Autoren danken dem gesamten ACEnano-Konsortium für die fruchtbaren Diskussionen in allen Phasen der Vorbereitung des hier vorgestellten Protokolls. Die Autoren schätzen auch die Finanzierung aus dem Programm Horizont 2020 der Europäischen Union (H2020) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 720952 im Rahmen des ACEnano-Projekts.

1. AF4-Systemaufbau
<ol><li>Montieren Sie die AF4-Patrone und schließen Sie alle Hardwarekomponenten des AF4-Systems und des UV-Vis-Detektors(Materialtabelle) gemäß den Anweisungen im Herstellerhandbuch an.</li>
	<li>Installieren Sie alle notwendigen Softwarepakete zur Steuerung, Datenerfassung, Verarbeitung und Auswertung gemäß den Anweisungen im Herstellerhandbuch.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Signalverbindungen zwischen dem AF4-System und dem UV-Vis-Detektor hergestellt wurden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die etablierten AF4-UV-vis-Verbindungen dicht und ohne Leckagen sind, indem Sie das Setup mit Reinstwasser (UPW) für 15 min spülen (Spitzendurchfluss 1 mL-min-1, Fokusdurchfluss 1 mL-min-1und Querdurchfluss rate 1,5 ml-min-1). Öffnen Sie dazu die Steuerungssoftware AF4 und geben Sie die Durchflussraten in die entsprechenden Panels auf der rechten oberen Seite der Zielseite ein. Ziehen Sie ggf. die entsprechenden Anschlüsse (Fittings) fest und wiederholen Sie den Vorgang, bis keine Leckagen erkennbar sind. HINWEIS: Der interne Systemdruck bei allen Messungen sollte überwacht werden und muss innerhalb von 4 bis 12 bar liegen. Wenn der Druck höher oder niedriger ist, müssen die Rückdruckschläuche angepasst werden. Darüber hinaus sollte der Kanaldrucktrend über die gesamte Messzeit konstant sein. HINWEIS: Wenn ein Kanalofen verfügbar ist, stellen Sie seine Temperatur auf 25 °C ein, um vergleichbare Messbedingungen während aller AF4-Experimente zu gewährleisten.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Lösungen und Suspensionen für DIE AF4-UV-vis Systemqualifizierung und Probenanalyse
<ol><li>Reinigungslösung<ol>
<li>8 g festes Natriumhydroxid (NaOH) und 2 g Natriumdodecylsulfat (SDS) zu 1 L UPW geben und die Lösung bis zur vollständigen Auflösung rühren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluent<ol>
<li>Fügen Sie 500 l gefiltertes Tensidgemisch zu 2 L gefiltertem und entgastem UPW hinzu, um das Eluent (0,025% (v/v), pH-Wert um 9,4 zu erhalten. ANMERKUNG: Eine detaillierte Beschreibung der Verbindungen des Tensidgemisches ist in Tabelle 1 (auch Materialtabelle) enthalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Willkürlicher AuNP-Größenstandard für die Massenrückgewinnungsbestimmung<ol>
<li>Vortex eine beliebige AuNP Größe Standard (50 mg-L -1) für 2 min und verdünnen Sie es 1:4 mit UPW, um eine endgültige Massenkonzentration von 12,5 mg-L-1zu erhalten. Wirbel für zusätzliche 2 min nach Verdünnung zur Homogenisierung der erhaltenen Suspension. VORSICHT: Bei der Arbeit mit Chemikalien, insbesondere NaOH-Pellets, sind notwendige Vorsichtsmaßnahmen und geeignete Schutzausrüstung erforderlich. HINWEIS: Es wird allgemein empfohlen, alle notwendigen Lösungen (mit Ausnahme der Reinigungslösung) mit einem 0,1 m-Membranfilter (hydrophiler PVDF oder ähnliches) zu entgasen und zu filtern, um einen geringen Partikelhintergrund während AF4-UV-vis-Experimenten zu gewährleisten. Dies kann entweder durch eine spezielle Vakuumfiltrationseinheit oder durch den Einsatz von Spritzenfiltern festgestellt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AF4-UV-vis Systemqualifikation
<ol><li>Verwenden Sie die in Schritt 1.4 beschriebenen Softwareeinstellungen, um das System mit der Reinigungslösung für 30 min zu spülen (Tip-Durchflussrate 1mL-min -1, Fokusdurchflussrate 1 mL-min-1und Kreuzdurchfluss rate 1,5 ml-min -1).</li>
	<li>Ändern Sie die jeweilige Eluentflasche und spülen Sie das System mit UPW für 20 min (Tip-Durchfluss 1 mL-min-1, Fokusdurchfluss 1 mL-min-1, und Kreuzdurchfluss 1,5 mL-min -1).</li>
	<li>Ersetzen Sie die entsprechenden Inline-Pumpenfilter.</li>
	<li>Öffnen Sie die AF4-Patrone und ersetzen Sie die AF4-Membran. Setzen Sie die AF4-Patrone wieder zusammen und schließen Sie sie wieder mit dem AF4-UV-vis-System an.</li>
	<li>Spülen Sie das gereinigte AF4-UV-vis-System mindestens 30 min mit dem Eluent, um die Membran auszudemt und das System zu stabilisieren (Tip-Durchflussrate 1 mL-min-1, Fokusdurchfluss rate 1 mL-min-1, und Kreuzdurchfluss rate 1,5 ml-min-1). Überprüfen Sie erneut auf mögliche Leckagen (siehe Schritt 1.4).</li>
	<li>Qualifizieren Sie das AF4-UV-vis-System, indem Sie die Massenrückgewinnung und Variation der Retentionszeit mithilfe eines beliebigen AuNP-Größenstandards bestimmen.<ol>
<li>Führen Sie einen Direkteinspritzlauf ohne Anwendung einer Trennkraft durch.<ol>
<li>Erstellen einer neuen Messdatei durch Öffnen der Datei| Neue | Führen Sie in der STEUERUNGSsoftware AF4 aus.</li>
			<li>Definieren Sie die Beispiel- und Messbeschreibung sowie das Injektionsvolumen und den Beispielnamen auf der Registerkarte Ausführen. Die Messbedingungen sind in Tabelle 2dargestellt.</li>
			<li>Legen Sie die Messparameter in der zweiten Tab-FFF-Methode gemäß Tabelle 2fest.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Messung zu starten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie einen Fraktionierungslauf mit Anwendung einer Trennkraft (Cross Flow) durch.<ol>
<li>Definieren Sie die Fraktionierungsmethode, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, mithilfe der in Tabelle 3angegebenen Fraktionierungsbedingungen .</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Messung zu starten.</li>
			<li>Führen Sie die Messung im Quadruplicate durch. HINWEIS: Der erste Lauf zielt darauf ab, das System (d. h. die AF4-Membran) zu konditionieren und wird von der abschließenden Bewertung der Systemqualifikationsergebnisse ausgeschlossen. HINWEIS: Es wird empfohlen, alle generierten Ausführungsdateien zu speichern, indem Sie Datei-| Speichern Sie in der STEUERUNGSsoftware AF4.</li>
			<li>Betrachten Sie das AF4-UV-vis-System qualifiziert, wenn eine Massenwiederherstellung von >80% und eine Variation der Retentionszeit <2% für den beliebigen AuNP-Größenstandard erhalten wird.</li>
			<li>Wenn Sie einen Autosampler als Einspritzsystem verwenden, füllen Sie die Nadelwaschbehälterflasche des Autosamplers mit der gleichen Lösung, die durch das AF4-UV-vis-System gepumpt wird (z. B. Reinigungslösung, UPW oder entsprechendes Eluent), um optimale Laufbedingungen zu gewährleisten. Beim Wechsel des Eluents wird generell empfohlen, die Wiederausgleich des AF4-Systems zu verfolgen, indem das UV-vis-Detektorsignal überwacht wird, bis seine Ausgangsbasis konstant stabil bleibt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. AF4-UV-vis Probenanalyse
<ol><li>Bereiten Sie alle AuNP-Größenstandards für die externe Größenkalibrierung vor, indem Sie die jeweilige AuNP-Suspension (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, je 50 mg) vorstrichen. L-1) für 2 min und verdünnen Sie es 1:4 mit UPW, um eine endgültige Massenkonzentration von 12,5 mg l-1zu erhalten. Wirbel für zusätzliche 2 min nach Verdünnung zur Homogenisierung der erhaltenen Suspensionen.</li>
	<li>Bereiten Sie die unbekannte AuNP-Probe für die Analyse vor, die das gleiche Verfahren wie für die in Schritt 4.1 beschriebenen Kalibrierstandards anwendet.</li>
	<li>Führen Sie eine Direkteinspritzung aller AuNP-Größenstandards mit der in Tabelle 2dargestellten AF4-Methode durch.<ol>
<li>Geben Sie dazu die entsprechenden Werte, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind, an den entsprechenden Stellen in die Software des Herstellers ein, um die Trenn- und Beispielparameter zu definieren, und drücken Sie die Run-Taste, um das Experiment zu starten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fraktionieren Sie jeden AuNP-Größenstandard einzeln mit der in Tabelle 3 dargestellten AF4-Methode, um die externe Größenkalibrierungsfunktion festzulegen.<ol>
<li>Geben Sie die entsprechenden Werte, die in Tabelle 3 zusammengefasst sind, an den entsprechenden Stellen in die Software des Herstellers ein. Die Fraktionierungsmethode wird durch einen Fokussierschritt, mehrere Elutionsschritte und einen Spülschritt definiert. Nachdem Sie die Methode eingerichtet haben, drücken Sie die Schaltfläche Ausführen, um das Experiment zu starten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine Direkteinspritzung der unbekannten AuNP-Probe mit der in Tabelle 2dargestellten AF4-Methode durch.</li>
	<li>Führen Sie die Fraktionierung der unbekannten AuNP-Probe durch, indem Sie die in Tabelle 3aufgeführte AF4-Methode durchführen.</li>
	<li>Führen Sie alle in Abschnitt 3 und 4 genannten Messungen in dreifacher Ausfertigung durch, sofern nicht anders angegeben, um aussagekräftige und statistisch relevante Ergebnisse zu gewährleisten.<ol>
<li>50 mg-L-1 AuNP-Lagersuspensionen bei 4–8 °C vor Gebrauch lagern. Verdünnte AuNP Suspensionen werden vor der Anwendung ideal erweise innerhalb von 30 min zubereitet. HINWEIS: Vortexing ist in der Regel ausreichend und es ist keine Ultraschallbehandlung der Suspensionen erforderlich.</li>
		<li>Um eine Korrelation der Retentionszeit der unbekannten AuNP-Probe mit den für die AuNP-Größenstandards erhaltenen Aufbewahrungszeiten zu ermöglichen, messen Sie alle Proben mit der gleichen AF4-Methode. ANMERKUNG: Um konstante und gültige Trennbedingungen zu gewährleisten, schließen Sie den im Abschnitt Systemqualifizierung (siehe Schritt 3.6.2) beschriebenen Fraktionierungsschritt nach einer definierten Anzahl von Stichprobenmessungen (z. B. 10 Messungen) ein./wiederholen Sie ihn. Darüber hinaus zeichnen Sie den Systemdruck und die Standeswertstabilität des UV-Vis-Detektors auf. Sie sollten während eines kompletten AF4-UV-vis-Laufs stabil und konstant bleiben. HINWEIS: Ersetzen Sie in der Regel die Ultrafiltrationsmembran, wenn der UV-Vis-Detektor (oder Der MalS-Detektor (Multi Angle Light Scattering, falls verfügbar) einen erhöhten Geräuschpegel anzeigt oder die definierten Systemqualifizierungskriterien wie Rückgewinnung, Probenspitzenform oder Wiederholbarkeit fehlen (oder das AF4-UV-vis-System einem gründlichen Reinigungsverfahren unterzogen wurde). Unter den hier beschriebenen Bedingungen ist das qualifizierte AF4-UV-vis-System in der Regel für mindestens 50 Messungen mit derselben Membran stabil; Die Anzahl möglicher aufeinanderfolgender Messungen, die die definierten Qualitätskriterien erfüllen, kann jedoch je nach Probe, Probenmatrix und Eluentenzusammensetzung erheblich variieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Datenauswertung
<ol><li>Führen Sie die Massenwiederherstellungsberechnung entweder mit der Datenauswertungssoftware des AF4-UV-vis-Systemherstellers oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (d.h. UV-vis Peak Area) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch durch.<ol>
<li>Berechnen Sie die AuNP-Massenrückgewinnung, indem Sie die Bereiche unter den jeweiligen UV-Vis-Spitzen der Fraktionierungsmessung (AFractionation) und der Direktinjektionsmessung (EineDirekteinspritzung) mit der folgenden Gleichung vergleichen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> HINWEIS: Bei einer Direktinjektionsmessung wird keine Trennkraft angewendet, so dass mögliche Wechselwirkungen einer Analytenart mit der Akkumulationswand vernachlässigt werden können. Die Fläche unter einem jeweiligen UV-Vis-Peak kann nach dem Beer-Lambert-Gesetz direkt mit der AuNP-Masse korreliert werden, vorausgesetzt, dass keine andere Art innerhalb der Probe bei der jeweiligen Wellenlänge absorbiert und/oder i) Elutes zu einer anderen Retentionszeit unter Fraktionierungsbedingungen ii) durch die AF4-Membran entfernt wird.</li>
		<li>Importieren Sie die dat.-Dateien, die sowohl aus der Direktinjektion als auch aus dem Fractionation-Lauf gewonnen wurden.</li>
		<li>Wählen Sie die UV-Vis-Detektorspur auf der Registerkarte Übersicht aus.</li>
		<li>Definieren Sie eine Region of Interest (ROI) und eine Baseline in der Signal- und Basisansicht für alle Messungen.</li>
		<li>Setzen Sie eine Direkteinspritzung Überlageein.</li>
		<li>Wählen Sie alle Direktinjektionsläufe in der Ansicht "Direkte Injektionskalibrierungseinstellungen" aus und geben Sie einen UV-Aussterbekoeffizienten ein. HINWEIS: Es ist wichtig, den gleichen UV-Vis-Aussterbekoeffizienten sowohl für die Kalibrierung als auch für die Fraktionierungsmessung zu verwenden.</li>
		<li>Richten Sie die Kalibrierlinie unter Verwendung des Bereichs unter der UV-vis-Signalspur innerhalb des ROI und der aus der eingegebenen Konzentration und dem Injektionsvolumen berechneten injizierten Menge ein. Die erhaltene Kalibrierung wird im separaten Fenster der Direkteinspritzungskalibrierungsfunktion angezeigt.</li>
		<li>Weisen Sie die Kalibrierfunktion den jeweiligen Fraktionierungsmessungen zu. HINWEIS: Für jeden Kalibriergrößenstandard und die unbekannte AuNP-Probe muss aufgrund der größenabhängigen UV-Vis-Absorption von AuNP eine separate Kalibrierfunktion eingerichtet werden. Dieser Nachteil des UV-Vis-Detektors kann mit einem massenempfindlichen Detektor wie einem ICP-MS umgangen werden.</li>
		<li>Führen Sie die Analysen durch Einfügen einer Berechnung der quantitativen Ergebnisse durch, und die Ergebnisse werden in einer Tabelle auf der rechten Seite als Konzentrations- und injizierte Mengenwerte angezeigt.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie die Variation der Aufbewahrungszeit mit der Datenauswertungssoftware des AF4-Systemherstellers oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (d.h. Aufbewahrungszeiten der AuNP-Kalibrierstandards zu den jeweiligen UV-vis-Spitzenmaxima und bzw. ungültigen Zeiten) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch.<ol>
<li>Öffnen Sie das Fenster Übersicht, um die entsprechenden UV-Spuren für alle importierten Messungen anzuzeigen.</li>
		<li>Die Spitzenerkennung wird automatisch durchgeführt; passen Sie die Spitzenerkennungsparameter in der Signalverarbeitungs-Toolbox an, um die Leistung zu optimieren. Extrahieren Sie die jeweilige Peak Maxima, indem Sie alle Messdateien durchgehen.</li>
		<li>Berechnen Sie die relative Standardabweichung für alle Messungen mit der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> Die Berechnung kann auch mit einer entsprechenden Tabellenkalkulationssoftware durchgeführt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Größenermittlung entweder mit der vom Hersteller bereitgestellten Datenauswertungssoftware oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (Aufbewahrungszeit bei UV-vis-Maximale an alyte und bzw. ungültiger Zeit) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch durch. Eine externe Größenkalibrierungsfunktion kann ermittelt werden, indem die lückenhaften, korrigierten Aufbewahrungszeiten (Nettoretentionszeiten, siehe Tabelle 5)der AuNP-Größenstandards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) anhand ihrer hydrodynamischen Größen dargestellt werden, die aus zuvor durchgeführten DLS-Messungen ermittelt wurden (siehe Tabelle 4). HINWEIS: Die DLS-Messungen sollten idealerweise am selben Tag wie die jeweiligen Fraktionierungsmessungen durchgeführt werden, um vergleichbare Probeneigenschaften zu gewährleisten.<ol>
<li>Nach dem Import der .dat Werden alle Messungen auf der Registerkarte Übersicht angezeigt. Wählen Sie das UV-Vis-Detektorsignal aus der Detektorliste aus, das unter dem Overlay-Fenster angezeigt wird. Definieren Sie für jede Messung einen ROI und einen Basiswert, der in der Signal- und Baseline-Ansicht angepasst werden kann. Verwenden Sie die Signalverarbeitungs-Toolbox auf der rechten Seite, um laute Signale zu glätten. Verwenden Sie die Funktion Verarbeitungsparameter anderen Runs zuweisen, damit die Parameter anderen Messungen bzw. Signalen zugeordnet werden können.</li>
		<li>Wählen Sie die Partikelgrößenkalibrierung auf der Registerkarte Einfügen aus.</li>
		<li>Wählen Sie alle Kalibrierläufe aus, indem Sie im Tabellenteil Referenzen für Kalibrierung auswählen auf der oberen rechten Seite auf die jeweilige Messung klicken. Alle ausgewählten Messungen werden in einer Tabelle unten angezeigt. Geben Sie den hydrodynamischen Radius für alle Kalibrierungsmessungen ein, die in Tabelle 4angegeben sind. Die Funktion wird im Partikelgrößenkalibrierungsfenster – Funktionsfenster und die Gleichung angezeigt. HINWEIS: Der Korrelationskoeffizient (R2) der etablierten Größenkalibrierungsfunktion muss ≥0,990 betragen.</li>
		<li>Weisen Sie die Kalibrierungsfunktion den Messungen der unbekannten AuNP-Probe zu, indem Sie die entsprechenden Fraktionen in der Liste "Läufe für Zuweisung auswählen" auswählen.</li>
		<li>Zeigen Sie die Ergebnisse an, indem Sie eine Partikelgrößenverteilungsberechnung innerhalb der Registerkarte Einfügen öffnen. Die zuvor erstellte Partikelgrößenkalibrierung wird als Kalibrierung für die unbekannten AuNP-Probenmessungen aufgeführt, die in den rechten Fenstereinstellungenangezeigt wird. Die berechnete Größe wird im Größenverteilungsfenster angezeigt, das auf das maximale Spitzenmaximum beschriftet ist. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Durchschnittliche Signale für Sample, um alle Messungen einer Probe zu durchschnittlichen, und listen Sie das Ergebnis in der maximalen Höchstbeschriftung auf.</li>
		<li>Zeichnen Sie außerdem die Kalibrierungslinie über das Fractogramm, indem Sie das Kontrollkästchen Kalibrierungskurve anzeigen aktivieren. Eine kumulative Größenverteilung ist verfügbar, indem Sie das Kontrollkästchen Kumulative Verteilung anzeigen aktivieren. HINWEIS: Wenn Sie die Software des Herstellers für die Datenauswertung verwenden, wird empfohlen, alle Ergebnisse zu einem Bericht hinzuzufügen, der durch Klicken auf Bericht auf der Registerkarte Einfügen generiert werden kann. Die Schaltfläche Bericht fügt einem Dokument alle Ergebnisse, Tabellen und Diagramme hinzu. Auf der Registerkarte Bericht können die Berichtseinstellungen geändert werden, indem Sie die Berichtseinrichtung im Abschnitt Dokument öffnen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Alle Autoren dieses Manuskripts sind Mitarbeiter der Postnova Analytics GmbH, deren Produkte in diesem Protokoll verwendet werden.

Die hydrodynamische Größe eines unbekannten AuNP wurde von AF4 genau bewertet, gekoppelt mit einem UV-Vis-Detektor mit genau definierten AuNP-Größenstandards von 20 nm bis 100 nm. Die entwickelte AF4-Methode wurde mit einem konstanten Cross-Flow-Profil optimiert, um eine lineare Beziehung zwischen gemessener Retentionszeit und AuNP-Größe herzustellen und so eine einfache Größenbestimmung aus der linearen Regressionsanalyse zu ermöglichen. Besonderes Augenmerk lag auch auf die Erreichung ausreichend hoher Rückgewinnungsraten, die auf keinen signifikanten Probenverlust während der Fraktionierung hindeuten, und darauf, dass die entwickelte AF4-Methode, einschließlich des angewendeten Eluenten und der Membran, gut mit allen fraktionierten AuNP-Proben übereinstimmte.
Die Methodenentwicklung ist wohl der wichtigste Schritt in AF4 und mehrere Parameter, einschließlich Kanalabmessungen, Strömungsparameter sowie Eluent, Membran, Abstandshöhe und sogar Probeneigenschaften müssen berücksichtigt werden, um die Fraktionierung innerhalb eines gegebenen Elutionszeitfensters zu verbessern. Der Zweck dieses Absatzes besteht darin, den Leser durch die kritischen Schritte zu führen, die optimiert wurden, um die Größe des unbekannten AuNP-Beispiels, das hier beschrieben wird, erfolgreich zu bestimmen. Für eine detailliertere Beschreibung der allgemeinen Entwicklung einer AF4-Methode wird der Leser auf den AF4-Abschnitt "ISO/TS21362:2018 - Nanotechnologien - Analyse von Nanoobjekten mit asymmetrischer Durchfluss- und Zentrifugalfeldflussfraktionierung"25verwiesen. Bei einem genaueren Blick auf die in Tabelle 3angegebenen angewandten Fraktionierungsbedingungen ist der erste kritische Schritt die Einführung und Entspannung der AuNP-Probe im AF4-Kanal. Dieser Schritt wird durch den Einspritzfluss, den Fokusfluss und den Querfluss gesteuert, deren Zusammenspiel die Probe zwingt, sich in der Nähe der Membranoberfläche zu lokalisieren und sie in einem schmalen Band in der Nähe des Injektionsports des AF4-Kanals zu konzentrieren, der im Grunde den Startpunkt der Fraktionierung definiert. Eine ausreichende Lockerung der Probe ist obligatorisch, da in diesem Schritt Probenbestandteile unterschiedlicher Größe in unterschiedlichen Höhen des AF4-Kanals lokalisieren und so die Grundlage für eine erfolgreiche Größenfraktionierung schaffen. Unvollständige Probenentspannung ist in der Regel durch eine erhöhte Hohlraumspitzenfläche sichtbar, die aus nicht zurückgehaltenen (d. h. nicht entspannten) Probenbestandteilen resultiert. Dieser Effekt kann durch eine Erhöhung der Injektionszeit und/oder der angewendeten Durchflussrate gemildert werden. Beide Parameter müssen jedoch sorgfältig optimiert werden, insbesondere für Proben, die anfällig für Agglomeration und Adsorption auf die AF4-Membran sind und durch die jeweiligen Rückgewinnungsraten für verschiedene Parametereinstellungen36,37überwacht werden können. Die angewendete Injektionszeit von 5 min zusammen mit einer Kreuzdurchflussrate von 1,0ml-min -1 ergab Rückgewinnungsraten >80% für alle AuNP-Proben und eine vernachlässigbare Hohlraumspitzenfläche, die nahezu optimale Entspannungsbedingungen anzeigt. Nach ausreichender Entspannung der AuNP-Probe wurde der Fokusstrom gestoppt und der Probentransport entlang der AF4-Kanallänge zum jeweiligen UV-Vis-Detektor eingeleitet, der den zweiten kritischen Schritt darstellt. Um eine ausreichend hohe Fraktionierungsleistung zu angemessenen Analysezeiten zu gewährleisten, wurde eine konstante Durchflussrate von 1,0 ml-min-1 für 30–50 min (abhängig vom jeweiligen fraktionierten AuNP-Größenstandard) gefolgt von einem 10 min linearen Querdurchflusszerfall bei einer Detektordurchflussrate von 0,5 ml.min-1 angewendet. Die Verwendung eines konstanten Cross-Flow-Profils über die Trennung aller AuNP-Größenstandards ergab eine lineare Beziehung zwischen Retentionszeit und AuNP-Größe nach FFF-Theorie22, wodurch die Größenbestimmung der unbekannten AuNP-Probe durch einfache lineare Regressionsanalyse ermöglicht wurde. Allerdings wurden andere Profile als ein konstanter Querfluss auch für die Dimensionierung von Nanopartikeln genutzt, was letztlich zu einer nichtlinearen Beziehung zwischen Retentionszeit und Partikelgröße38,39führt. Darüber hinaus ist die Größenbestimmung in AF4 mit genau definierten Größenstandards nicht auf AuNP beschränkt, sondern kann auch auf Nanopartikel mit anderen Größen und Elementarzusammensetzungen (z.B. Silber38,40 oder Kieselsäure-Nanopartikel41,42)angewendet werden. Darüber hinaus ist ICP-MS bei der Arbeit mit verdünnten Proben ein hochempfindlicher Elementardetektor, der mit AF4 gekoppelt werden kann, was die Vielseitigkeit dieses analytischen Ansatzes zur Dimensionierung einer Vielzahl von Nanopartikeln in Suspensionen ergänzt.
Trotz seiner weit verbreiteten Anwendung hat die externe Größenkalibrierung mit genau definierten Größenstandards in AF4 einige Besonderheiten, die bei der Verwendung für die genaue Dimensionierung unbekannter Proben berücksichtigt werden müssen. Zunächst beruht sie in hohem Maße auf der Anwendung vergleichbarer Bedingungen bei der Fraktionierung der jeweiligen Größennormen und der tatsächlichen Stichprobe. In dem hier dargestellten Fall ist es daher zwingend erforderlich, dass sowohl die AuNP-Größenstandards als auch die unbekannte AuNP-Probe nach der gleichen AF4-Methode sowie das gleiche Eluent und dieselbe Membran fraktioniert werden, was diesen Ansatz ziemlich unflexibel macht. Da keine größenempfindlichen Detektoren, z. B. Lichtstreuung (MALS und DLS), zur Hand sind, ist es zudem schwierig festzustellen, ob eine entsprechende AF4-Methode mit Größenstandards ausreichend gut funktioniert oder nicht. Dies gilt insbesondere für unbekannte Proben, die sehr große Größenverteilungen aufweisen, wobei unklar bleibt, ob alle Probenbestandteile dem normalen Elutionsmuster folgen: Fraktionierung von kleineren zu größeren Partikeln, oder ob größere Probenbestandteile bereits im sterisch-hyperlayer-Modus leuchten, wodurch potenziell mit kleineren Probenbestandteilen43,44ko-eluiert werden. Auch wenn die FFF-Theorie betont, dass AF4-Trennungen allein aufgrund von Unterschieden in der hydrodynamischen Größe mit Teilchen, die als Punktmassen betrachtet werden, ohne Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung22,eine andere Geschichte mit Partikel-Partikel- und Partikel-Membran-Wechselwirkungen (wie elektrostatische Anziehung/Abstoßung oder Van-der-Waals-Attraktion) spielen können und möglicherweise eine messbare Verzerrung in Größenbestimmung über externe Größenkalibrierung45,46einführen. Es wird daher empfohlen, Größennormen zu verwenden, die ideal auf die Zusammensetzung und die Oberflächeneigenschaften (Zeta-Potenzial) des Teilchens40,42 oder, wenn diese nicht verfügbar sind, zumindest gut charakterisierte Partikelgrößenstandards (z. B. Polystyrollatexpartikel) zu verwenden und ihre Vergleichbarkeit mit dem Teilchen von Interesse insbesondere hinsichtlich ihres Oberflächen-Zeta-Potenzials in der jeweiligen Umgebung, in dem die Analyse durchgeführt werden soll, sorgfältig zu bewerten41,47.
Die Vielseitigkeit von AF4 wird oft als seine größte Stärke angesehen, da es einen Anwendungsbereich bietet, der über die meisten anderen gängigen Größentechniken in diesem Bereich hinausgeht22,48,49. Gleichzeitig kann es aufgrund seiner damit verbundenen mutmaßlichen Komplexität auch als sein wichtigster Nachteil angesehen werden, insbesondere gegen schnelle und vorgeblich einfach zu bedienende Größentechniken wie DLS, Nanopartikel-Tracking-Analyse oder Single-Partikel-ICP-MS. Wenn man AF4 jedoch mit diesen populären Größentechniken relativiert, wird deutlich, dass alle Techniken ihre Vor- und Nachteile haben, aber alle tragen zu einem umfassenderen Verständnis der physikalisch-chemischen Natur von Nanopartikeln bei und sollten daher als komplementär und nicht als wettbewerbsfähig betrachtet werden.
Das hier vorgestellte Standard-Betriebsverfahren (SOP) unterstreicht die hervorragende Anwendbarkeit von AF4-UV-vis mit externer Größenkalibrierung für die Dimensionierung einer unbekannten AuNP-Probe in Suspension und wurde schließlich als empfohlene Richtlinie für die AF4-Analyse einer unbekannten AuNP-Probe im Rahmen eines internationalen Laborvergleichs (ILC) angewendet, der im Rahmen des Horizon 2020-Projekts ACEnano durchgeführt wurde (das Ergebnis dieser ILC wird Gegenstand einer zukünftigen Veröffentlichung sein). Dieses Protokoll ergänzt somit die ermutigenden und laufenden internationalen Bemühungen zur Validierung und Standardisierung der AF4-Methoden25,50,51,52 und unterstreicht das vielversprechende Potenzial von AF4 auf dem Gebiet der Nanopartikelcharakterisierung.

Gold-Nanopartikel (AuNP) in Form von kolloidalem Gold waren schon lange vor dem Verständnis der Nanopartikel und bevor der Begriff Nanopartikel seinen Weg in das zeitgenössische, wissenschaftliche Vokabular gefunden hatte, ein Teil der menschlichen Kultur gewesen. Ohne besondere Kenntnis ihres nanoskaligen Aussehens wurde die suspendierte AuNP bereits im alten China, Arabien und Indien im V-VI Jahrhundert1für medizinische und andere Zwecke verwendet, und auch die alten Römer nutzten ihre rubinrote Farbe, um ihre Keramik in der Lycurgus-Cup-Ausstellung im British Museum2zu färben. In der westlichen Welt, im Laufe der Jahrhunderte vom Mittelalter bis zur Neuzeit, suspendiert AuNP wurden vorwiegend als Farbstoffe für Glas und Emaille (Lila von Cassius)3 sowie zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten (Potable Gold), vor allem Syphilis4.
Jedoch, alle diese Studien hatten sich in erster Linie auf die Anwendung der ausgesetzten AuNP konzentriert und es war an Michael Faraday im Jahr 1857, den ersten rationalen Ansatz einzuführen, um ihre Bildung, ihre Art sowie ihre Eigenschaften zu untersuchen5. Obwohl Faraday bereits wusste, dass diese AuNP sehr winzige Dimensionen haben muss, war es erst die Entwicklung der Elektronenmikroskopie, als explizite Informationen über ihre Größenverteilung zugänglich waren6,7, was schließlich die Korrelation zwischen Größe und anderen AuNP-Eigenschaften ermöglichte.
Heute, dank ihrer ziemlich einfachen und einfachen Synthese, bemerkenswerten optischen Eigenschaften (Oberflächen-Plasmonresonanz), gute chemische Stabilität und damit geringe Toxizität sowie ihre hohe Vielseitigkeit in Bezug auf verfügbare Größen und Oberflächenmodifikationen, AuNP haben weit verbreitete Anwendungen in Bereichen wie Nanoelektronik8, Diagnostik9, Krebstherapie10oder Medikamentenabgabe11gefunden. Natürlich ist für diese Anwendungen die genaue Kenntnis der Größe und Größenverteilung des angewandten AuNP eine Grundvoraussetzung, um eine optimale Wirksamkeit zu gewährleisten12, und es besteht ein erheblicher Bedarf an robusten und zuverlässigen Werkzeugen zur Bestimmung dieses entscheidenden physikalisch-chemischen Parameters. Heute gibt es eine Vielzahl von Analytischen Techniken, die AuNP in Suspension dimensionieren können, einschließlich, zum Beispiel UV-vis-Spektroskopie (UV-vis)13, Dynamic Light Scattering (DLS)14 oder Single Particle Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (spICP-MS)15 mit Field-Flow Fractionation (FFF) als Schlüsselakteur in diesem Bereich16,17,18,19,20.
Erstmals 1966 von J. Calvin Giddings21konzipiert, umfasst FFF eine Familie von elutionsbasierten Fraktionierungstechniken, bei denen die Trennung innerhalb eines dünnen, bandartigen Kanals ohne stationäre Phase22,23stattfindet. In FFF wird die Trennung durch die Wechselwirkung einer Probe mit einem externen Kraftfeld induziert, das senkrecht zur Richtung eines laminaren Kanalflusses wirkt, bei dem die Probe in der Regel flussabwärts zu den jeweiligen Inline-Detektoren transportiert wird. Unter diesen verwandten FFF-Techniken ist die asymmetrische Durchflussfeld-Flussfraktion (AF4), bei der ein zweiter Durchfluss (Kreuzfluss) als Kraftfeld fungiert, zum am häufigsten verwendeten Subtyp24geworden. In AF4 ist der Kanalboden (Akkumulationswand) mit einer halbdurchlässigen Ultrafiltrationsmembran ausgestattet, die in der Lage ist, die Probe zu halten und gleichzeitig den Querfluss durch die Membran passieren zu lassen und den Kanal über einen zusätzlichen Ausgang zu verlassen. Auf diese Weise kann der Querstrom die Probe zur Akkumulationswand schieben und so ihrem diffusionsinduzierten Fluss (Brownsche Bewegung) entgegenwirken. In einem resultierenden Gleichgewicht von feld- und diffusionsinduzierten Flussarten; kleinere Probenbestandteile mit höheren Diffusionskoeffizienten richten sich näher am Kanalzentrum aus, während größere Probenbestandteile mit niedrigeren Diffusionskoeffizienten näher an der Akkumulationswand liegen. Durch das parabolische Strömungsprofil innerhalb des Kanals werden daher kleinere Probenbestandteile in den schnelleren Laminaen des Kanalflusses transportiert und vor größeren Probenbestandteilen elute. Mit FFF-Retentionsparametern und Stokes-Einstein-Diffusionskoeffizientengleichungen können dann die Elutionszeit bzw. das Elutionsvolumen einer Probe in AF4 direkt in ihre hydrodynamische Größe22übersetzt werden. Hier bezieht sich das beschriebene Elutionsverhalten auf den normalen Elutionsmodus und gilt in der Regel für AF4 innerhalb eines Partikelgrößenbereichs zwischen ca. 1–500 nm (manchmal bis zu 2000 nm je nach Partikeleigenschaften und Fraktionierungsparametern), während die sterisch-hyperlayerElution in der Regel oberhalb dieses Größenschwellenwerts25auftritt.
Es gibt drei gängige Möglichkeiten, Größeninformationen nach der Trennung durch FFF abzuleiten. Da FFF ein modulares Instrument ist, kann es nachgeschaltet mit mehreren Detektoren wie größenempfindlichen Lichtstreudetektoren nach dem Prinzip der Multi-Angle Light Scattering (MALS)26,27, Dynamic Light Scattering (DLS)28,29oder sogar einer Kombination aus beidem kombiniert werden, um zusätzliche Forminformationen zu erhalten30,31. Da jedoch das Retentionsverhalten einer Probe in einem FFF-Kanal im Allgemeinen durch genau definierte physikalische Kräfte gesteuert wird, kann die Größe auch mit einem mathematischen Ansatz (FFF-Theorie) berechnet werden, bei dem ein einfacher Konzentrationsdetektor (z.B. ein UV-Vis-Detektor) ausreicht, um das Vorhandensein einer eluierenden Probe32,33anzuzeigen.
Als dritte Option berichten wir hier über die Anwendung einer externen Größenkalibrierung34,35 unter Verwendung klar definierter AuNP-Standards im Größenbereich von 20–100 nm für die Dimensionierung einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe in Suspension mit AF4 gekoppelt mit UV-Vis-Detektion. Dieses einfache Versuchsgebildt wurde absichtlich gewählt, um möglichst vielen Laboratorien die Teilnahme an einem internationalen Interlaborationsvergleich (ILC) zu ermöglichen, der später im Rahmen des Horizont-2020-Projekts ACEnano der Europäischen Union auf der Grundlage des hier vorgestellten Protokolls durchgeführt wurde.

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;micro;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-FIL-TEF-002</td><td>Used for filtration of aqueous solutions</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td><td>Merck Millipore</td><td>Durapore Millex</td><td>Used for filtration of NovaChem100</td></tr><tr><td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>Research Plus</td><td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>AF4 cartridge</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td><td>Sartorius</td><td>ENTRIS124I-1S</td><td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN5300</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Channel Oven</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN4020</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Crossflow Module</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF Control Module</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Disposable Pipette Tips (1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>ep T.I.P.S</td><td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td><td>neoLab</td><td>1-0199</td><td>Used for eluent storage</td></tr><tr><td>Focus Pump</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1131</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>VIA-002</td><td>Used for sample storage</td></tr><tr><td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaCal Gold</td><td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td></tr><tr><td>Magnetic Stirrer</td><td>IKA</td><td>VIBRAX-VXR</td><td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td></tr><tr><td>Personal Computer (PC)</td><td>Dell Technologies</td><td>/</td><td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td></tr><tr><td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td><td>/</td><td>/</td><td>In accordance with respective laboratory&amp;rsquo;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td></tr><tr><td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-VIA-09150868</td><td>Used for sample storage</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &amp;ge;99 %, Blotting Grade</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; Co KG</td><td>2326.1</td><td>Used for the preparation of the cleaning solution</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &amp;ge;98 %, p.a</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; Co KG</td><td>6771.1</td><td>Used for the preparation of the cleaning solution</td></tr><tr><td>Software Package for Control and Data Acquisition</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaFFF AF2000 Software</td><td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td></tr><tr><td>Software Package for Data Evaluation</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaAnalysis Software</td><td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td></tr><tr><td>Software Package for final Data Processing</td><td>OriginLab Corporation</td><td>Origin 2019</td><td>Used for final data processing</td></tr><tr><td>Solvent Degasser</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7520</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Solvent Selector</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7310</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Solvent Organizer</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7140</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Surfactant Mixture</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaChem100</td><td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td></tr><tr><td>Tip Pump</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1130</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Unknown AuNP sample</td><td>BBI Solutions</td><td>EM.GC60</td><td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td></tr><tr><td>UV-vis Detector</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN3211</td><td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td></tr><tr><td>Vacuum Filtration Unit</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Eluent Filtration System</td><td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>Vortex Genie 2</td><td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>Water Purification System</td><td>Merck Millipore</td><td>Milli-Q Integral 5</td><td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&amp;Omega;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td></tr></tbody></table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

Die Partikelgröße ist wohl der wichtigste physikalisch-chemische Parameter, der mit dem Begriff eines Nanopartikels verbunden ist. Genaue Kenntnisse der Größe und Größenverteilung von Nanopartikeln sind für verschiedene Anwendungen von größter Bedeutung. Der Größenbereich ist ebenfalls wichtig, da er die "aktivste" Komponente einer Nanopartikeldosis definiert.
Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung (AF4) ist eine leistungsstarke Technik zur Dimensionierung von Partikeln in Suspension im Größenbereich von ca. 1–1000 nm. Es gibt mehrere Möglichkeiten, Größeninformationen aus einem AF4-Experiment abzuleiten. Neben der Online-Kopplung von AF4 mit größenempfindlichen Detektoren, die auf den Prinzipien der Multi-Angle Light Scattering oder Dynamic Light Scattering basieren, besteht auch die Möglichkeit, die Größe einer Probe mit ihrer Retentionszeit nach einem etablierten theoretischen Ansatz (FFF-Theorie) oder durch vergleicht es mit den Retentionszeiten von genau definierten Partikelgrößenstandards (externe Größenkalibrierung) zu korrelieren.
Wir beschreiben hier die Entwicklung und interne Validierung eines Standard-Betriebsverfahrens (SOP) zur Dimensionierung einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe durch AF4 gekoppelt mit UV-Vis-Detektion mittels externer Größenkalibrierung mit Gold-Nanopartikel-Standards im Größenbereich von 20–100 nm. Dieses Verfahren bietet eine detaillierte Beschreibung des entwickelten Workflows einschließlich Probenvorbereitung, AF4-Instrumentenaufbau und -Qualifizierung, AF4-Methodenentwicklung und -Fraktionierung der unbekannten Gold-Nanopartikelprobe sowie die Korrelation der erhaltenen Ergebnisse mit der etablierten externen Größenkalibrierung. Das hier beschriebene SOP wurde schließlich im Rahmen einer interlaborativen Vergleichsstudie erfolgreich validiert, die die hervorragende Robustheit und Zuverlässigkeit von AF4 für die Dimensionierung von Nanopartikelproben in Suspensionen hervorhebt.

Zunächst wurden die AuNP-Größenstandards durch AF4 fraktioniert und durch UV-vis-Messung der Absorption der AuNP bei einer Wellenlänge von 532 nm (Oberflächen-Plasmonresonanz von AuNP) nachgewiesen. Eine Überlagerung der erhaltenen Fraktogramme ist in Abbildung 1dargestellt. Die Retentionszeiten jedes AuNP an seinem jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum, das aus dreifachen Messungen gewonnen wird, sind in Tabelle 5aufgeführt. Die relative Standardabweichung aller Retentionszeiten lag unter 1,1% bei abnehmender Messabweichung mit zunehmender Größe. Insgesamt wurde eine hervorragende Wiederholbarkeit erreicht. Es wurde eine konstante Trennkraft angewendet, die zu einem linearen Verhältnis von Elutionszeit und hydrodynamischer Größe führte. Die externe Größenkalibrierungslinie wurde durch Plotten des angegebenen hydrodynamischen Radius gegen die nullzeit korrigierte Elutionszeit (Netto-Retentionszeit) ermittelt. Eine lineare Regressionsanalyse ergab eine lineare Kalibrierfunktion mit einem Intercept a = -3,373 nm ± 1,716 nm und einer Steigung b = 1,209nm-min -1 ± 0,055 nm'min-1. Das lineare Verhalten der Elution wurde mit einem quadrierten Korrelationskoeffizienten R2 von 0,9958 bestätigt. Die jeweilige Kalibrierfunktion wird in Abbildung 2visuell dargestellt.
Der zweite Teil befasste sich mit der Analyse der unbekannten AuNP-Probe. Drei Aliquots der Probe wurden nach dem im Protokollabschnitt beschriebenen Verfahren (Abschnitt 4.2) erstellt. Jeder der drei Aliquots wurde in Dreifacharbeit mit der gleichen AF4-Fraktionierungsmethode untersucht, die auch für die AuNP-Größenstandards angewendet wurde. Alle neun AF4-UV-vis-Fraktogramme, die aus der unbekannten AuNP-Probe gewonnen wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt und ihre jeweiligen Auswertungen sind in Tabelle 6zusammengefasst. Die relative Standardabweichung der jeweiligen Retentionszeiten war signifikant gering und lag zwischen 0,1% und 0,5%. Mit Der Partikelgrößenkalibrierungsfunktion, die aus der Fraktionierung der AuNP-Größenstandards gewonnen wurde und sie mit den erhaltenen Retentionszeiten der unbekannten AuNP-Probe am UV-vis-Spitzenmaximum korreliert, konnte ein durchschnittlicher hydrodynamischer Gesamtradius von 29,4 nm ± 0,2 nm berechnet werden. Darüber hinaus wurde eine angemessene Massenrückgewinnung von 83,1 % ± 1,2 % erzielt, was auf keine signifikante Agglomeration oder Auflösung der AuNP-Probe oder eine erhebliche Adsorption von Partikeln auf die Membranoberfläche hindeutet. Abbildung 4 zeigt die erhaltene Partikelgrößenverteilung mit allen neun UV-vis-Signalspuren, die im Durchschnitt die hervorragende Robustheit der angewendeten AF4-Methode hervorheben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> Abbildung 1: AF4-UV-vis Fraktogramme, die aus der dreifachen Analyse der vier einzelnen AuNP-Größenkalibrierungsstandards mit normalisierten Signalintensitäten und angewendeter konstanter Durchflussrate (schwarze Linie) gewonnen werden. Die Leertaste wird in etwa 5,9 min grau hervorgehoben. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> Abbildung 2: Erhaltene externe Größenkalibrierungsfunktion, einschließlich Fehlerbalken, die aus den jeweiligen Standardabweichungen der DLS-Messungen (Tabelle 4) und Varianzen in den erhaltenen AF4-Retentionszeiten (Tabelle 5) abgeleitet wurden, nachdem der angegebene hydrodynamische Radius mit der Retentionszeit jedes einzelnen AuNP-Größenkalibrierungsstandards an seinem jeweiligen Spitzenmaximum dargestellt wurde. Aus einer linearen Regressionsanalyse wurde eine lineare Kalibrierfunktion mit Standardfehlern in Form von y = a + bx mit a = -3.373 nm ± 1.716 nm und b = 1.209 nm'min-1 ± 0.055 nm'min-1 berechnet. Es wurde ein quadrierter Korrelationskoeffizient mit R2 = 0,9958 ermittelt, der auf eine lineare Beziehung hinweist. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> Abbildung 3: AF4-UV-vis Fractogramme von dreifachen Messungen von drei Aliquots, die das unbekannte AuNP anzeigen. Der angewendete konstante Durchflussüberfluss über die Messzeit wird als schwarze Linie dargestellt. Der Leerstrich bei etwa 5,9 min wird grau hervorgehoben. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> Abbildung 4: Überlagerung der erhaltenen durchschnittlichen Partikelgrößenverteilung (rot) der unbekannten AuNP-Probe und der angewendeten linearen Kalibrierfunktion (gepunktete Linie). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Komponente</td>
			<td>CAS-Nr.</td>
			<td>Gewicht (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Wasser</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-Octadecenoic acid (Z)-, Verbindung mit 2,2',2''-Nitrilotris[Ethanol](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Natriumcarbonat</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Alkohole, C12-14-sekundär, ethoxyliert</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tetranatrium EDTA</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Polyethylenglykol</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Natriumoleat</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Natriumbicarbonat</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der Bestandteile des Tensidgemisches, das zur Herstellung des Eluentenverwendeters verwendet wird (siehe auch Werkstofftabelle).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis Parameter</td>
			<td>Einheit</td>
			<td>Wert</td>
		</tr>
<tr>
<td>Abstandsstärke</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detektordurchfluss</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kreuzdurchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0 (konstant für 8 min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fokusdurchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verzögerungszeit / Stabilisierungszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionsdurchfluss</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Übergangszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elutionsschritt</td>
			<td>Min</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spülen Sie Schrittzeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spülen Schritt durchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionsvolumen</td>
			<td>Μl</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Probenkonzentration</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membrantyp</td>
			<td></td>
			<td>Regenerierte Cellulose</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membran-Molekulargewichts-Cut-off</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluent</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) Tensidmischung</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis Wellenlänge</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-Vis-Empfindlichkeit</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Zusammenfassung der Parameter der AF4-UV-vis-Fraktionierungsmethode zur Durchführung des Direkteinspritzlaufs ohne Anwendung einer Trennkraft.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis Parameter</td>
			<td>Einheit</td>
			<td>Wert</td>
		</tr>
<tr>
<td>Abstandsstärke</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detektordurchfluss</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kreuzdurchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1 (60 min konstant, 10 min linear)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fokusdurchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verzögerungszeit / Stabilisierungszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionsdurchfluss</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Übergangszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elutionsschritt</td>
			<td>Min</td>
			<td>70 (60 min konstant, 10 min linear)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spülschritt</td>
			<td>Min</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spülen Schritt durchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionsvolumen</td>
			<td>Μl</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Probenkonzentration</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membrantyp</td>
			<td></td>
			<td>Regenerierte Cellulose</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membran-Molekulargewichts-Cut-off</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluent</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) Tensidmischung</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis Wellenlänge</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-Vis-Empfindlichkeit</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Zusammenfassung der Parameter der AF4-UV-vis-Fraktionierungsmethode, um den Fraktionierungslauf unter Anwendung eines Querflusses als Trennkraft durchzuführen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kalibrierstandard</td>
			<td>Verschlussmittel</td>
			<td>Mittlere Größe (TEM) (nm)</td>
			<td>Lebenslauf (mittlere Größe TEM) (%)</td>
			<td>Zeta-Potenzial (mV)</td>
			<td>SD (Zetapotential) (mV)</td>
			<td>Hydrodynamischer Radius (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (hydrodynamischer Radius) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>Citrat</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>Citrat</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>Citrat</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>Citrat</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Zusammenfassung der physikalisch-chemischen Parameter der angewandten AuNP-Kalibrierstandards, einschließlich Verschlussmittel, TEM-Mittelgröße, Zeta-Potenzial, das in der nativen Suspension bestimmt wird, sowie des hydrodynamischen DLS-Radius und des im Eluent ermittelten Polydispersitätsindex (PDI).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kalibrierstandard</td>
			<td>Ausführen</td>
			<td>Retentionszeit bei Maximaler Höchstgeschwindigkeit (min)</td>
			<td>Netto-Retentionszeit bei Maximaler Spitze (min)</td>
			<td>Durchschnittliche Netto-Einbehaltungszeit (min)</td>
			<td>SD (%) (Netto-Aufbewahrungszeit)</td>
			<td>SD (min) (Netto-Aufbewahrungszeit)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 5: Retentionszeiten der AuNP-Kalibrierstandards am jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum abgeleitet aus den jeweiligen AF4-UV-vis Fraktogrammen nach dem in Tabelle 3beschriebenen Verfahren.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aliquote</td>
			<td>Ausführen</td>
			<td>Haltezeit maximum (min)</td>
			<td>Durchschnittliche Retentionszeit bei Höchstgeschwindigkeit (min)</td>
			<td>Netto-Retentionszeit bei Maximaler Spitze (min)</td>
			<td>SD (%) Aufbewahrungszeit</td>
			<td>Hydrodynamischer Radius (nm)</td>
			<td>Erholung (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 6: Zusammenfassung der Retentionszeiten am jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum, des hydrodynamischen Radius, der aus der externen Größenkalibrierung berechnet wird (Abbildung 2) und der Rückgewinnungsrate der unbekannten AuNP-Probe aus der AF4-UV-vis-Analyse.

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Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von asymmetrischer Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung in Verbindung mit UV-vis-Detektion zur Bestimmung der Größe einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe.

Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung zur Dimensionierung von Gold-Nanopartikeln in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.1K Aufrufe.  Postnova Analytics GmbH. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von asymmetrischer Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung in Verbindung mit UV-vis-Detektion zur Bestimmung der Größe einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe.

Serie: Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Fabrication, Operation and Flow Visualization in Surface-acoustic-wave-driven Acoustic-counterflow Microfluidics

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we present the fabrication protocol for a multilayered SAW acoustic counterflow device. The device is fabricated starting from a lithium niobate (LN) substrate onto which two interdigital transducers (IDTs) and appropriate markers are patterned. A polydimethylsiloxane (PDMS) channel cast on an SU8 master mold is finally bonded on the patterned substrate. Following the fabrication procedure, we show the techniques that allow the characterization and operation of the acoustic counterflow device in order to pump fluids through the PDMS channel grid. We finally present the procedure to visualize liquid flow in the channels. The protocol is used to show on-chip fluid pumping under different flow regimes such as laminar flow and more complicated dynamics characterized by vortices and particle accumulation domains.

In this video we first describe fabrication and operation procedures of a surface acoustic wave (SAW) acoustic counterflow device. We then demonstrate an experimental setup that allows for both qualitative flow visualization and quantitative analysis of complex flows within the SAW pumping device.

Fabrication, Operation and Flow Visualization in Oberflächenschallwellen-wave-driven Acoustic-Gegenstrom Mikrofluidik

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we ...

Forschung

Ingenieurwesen

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed assembly1-3, drug delivery4, improved hydrocarbon recovery5-7, and flowable electrodes for energy storage8. Suspensions containing fluorescent colloids and non-adsorbing polymers are appealing model systems, as the ratio of the polymer radius of gyration to the particle radius&#160;and concentration of polymer control the range and strength of the interparticle attraction, respectively. By tuning the polymer properties and the volume fraction of the colloids, colloid fluids, fluids of clusters, gels, crystals, and glasses can be obtained9.&#160;Confocal microscopy, a variant of fluorescence microscopy, allows an optically transparent and fluorescent sample to be imaged with high spatial and temporal resolution in three dimensions. In this technique, a small pinhole or slit blocks the emitted fluorescent light from regions of the sample that are outside the focal volume of the microscope optical system. As a result, only a thin section of the sample in the focal plane is imaged. This technique is particularly well suited to probe the structure and dynamics in dense colloidal suspensions at the single-particle scale: the particles are large enough to be resolved using visible light and diffuse slowly enough to be captured at typical scan speeds of commercial confocal systems10. Improvements in scan speeds and analysis algorithms have also enabled quantitative confocal imaging of flowing suspensions11-16,37.&#160;In this paper, we demonstrate confocal microscopy experiments to probe the confined phase behavior and flow properties of colloid-polymer mixtures. We first prepare colloid-polymer mixtures that are density- and refractive-index matched. Next, we report a standard protocol for imaging quiescent dense colloid-polymer mixtures under varying confinement in thin wedge-shaped cells. Finally, we demonstrate a protocol for imaging colloid-polymer mixtures during microchannel flow.

Confocal microscopy is used to image quiescent and flowing colloid-polymer mixtures, which are studied as model systems for attractive suspensions. Image analysis algorithms are used to calculate structural and dynamic metrics for the colloidal particles that measure changes due to geometric confinement.

Die konfokale Bildgebung von Enge und Ruhe Fließende Kolloid-Polymer-Mischungen

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

Chemie

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

Millifluidics für Chemische Synthese und Zeitaufgelöste mechanistische Studien

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Biotechnik

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a microfluidic chamber assembled in the specimen holder for Transmission Electron Microscopy (TEM) and STEM. The microfluidic system consists of two silicon microchips supporting thin Silicon Nitride (SiN) membrane windows. This article describes the basic steps of sample loading and data acquisition. Most important of all is to ensure that the liquid compartment is correctly assembled, thus providing a thin liquid layer and a vacuum seal. This protocol also includes a number of tests necessary to perform during sample loading in order to ensure correct assembly. Once the sample is loaded in the electron microscope, the liquid thickness needs to be measured. Incorrect assembly may result in a too-thick liquid, while a too-thin liquid may indicate the absence of liquid, such as when a bubble is formed. Finally, the protocol explains how images are taken and how dynamic processes can be studied. A sample containing AuNPs is imaged both in pure water and in saline.

This protocol describes the operation of a liquid flow specimen holder for scanning transmission electron microscopy of AuNPs in water, as used for the observation of nanoscale dynamic processes.

Studium dynamischer Prozesse von Nano-Größe Objekte in Liquid Scanning Transmission Electron Micros mit

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

The Diffusion of Passive Tracers in Laminar Shear Flow

A simple method to experimentally observe and measure the dispersion of a passive tracer in a laminar fluid flow is described. The method consists of first injecting fluorescent dye directly into a pipe filled with distilled water and allowing it to diffuse across the cross-section of the pipe to obtain a uniformly distributed initial condition. Following this period, the laminar flow is activated with a programmable syringe pump to observe the competition of advection and diffusion of the tracer through the pipe. Asymmetries in the tracer distribution are studied and correlations between the pipe cross-section and the shape of the distribution is shown: thin channels (aspect ratio &#60;&#60; 1) produce tracers arriving with sharp fronts and tapering tails (front-loaded distributions), while thick channels (aspect ratio ~1) present the opposite behavior (back-loaded distributions). The experimental procedure is applied to capillary tubes of various geometries and is particularly relevant to microfluidic applications by dynamical similarity.

A protocol for the study of the diffusion of passive tracers in laminar pressure-driven flow is presented. The procedure is applicable to various capillary pipe geometries.

Die Diffusion von passiven Tracern in laminaren Schubfluss

A simple method to experimentally observe and measure the dispersion of a passive tracer in a laminar fluid flow is described. The method consists of ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). Characterization needs to be thorough and the technique chosen should be well-suited to the property to be determined, the material being analyzed and the medium in which it is present. Furthermore, the instrument operation and methodology need to be well-developed and clearly understood by the user to avoid data collection errors. Any discrepancies in the applied method or procedure can lead to differences and poor reproducibility of obtained data. This paper aims to clarify the method to measure the hydrodynamic diameter of gold nanoparticles by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). This study was carried out as an inter-laboratory comparison (ILC) amongst seven different laboratories to validate the standard operating procedure&#8217;s performance and reproducibility. The results obtained from this ILC study reveal the importance and benefits of detailed standard operating procedures (SOPs), best practice updates, user knowledge, and measurement automation.

The protocol described here aims to measure the hydrodynamic diameter of spherical nanoparticles, more specifically gold nanoparticles, in aqueous media by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The latter involves tracking the movement of particles due to Brownian motion and implementing the Stokes-Einstein equation to obtain the hydrodynamic diameter.

Nanopartikel-Tracking-Analyse von Gold-Nanopartikeln in wässrigen Medien durch einen interlaborativen Vergleich

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.

Gold-Nanopartikel-Synthese

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the physiological and pathological state of a cell. However, there is no standard method for sEV isolation, which prevents downstream biomarker identification and drug intervention studies. In this article, we provide a detailed protocol for the isolation and purification of 50-200 nm sEV by a flow cell sorter. For this, a 50 &#181;m nozzle and 80 psi sheath fluid pressure were selected to obtain a good sorting rate and stable side stream. Standard sized polystyrene microspheres were used to locate populations of 100, 200, and 300 nm particles. With additional optimization of the voltage, gain, and forward scatter (FSC) triggering threshold, the sEV signal could be separated from the background noise. These optimizations provide a panel of critical sort settings that enables one to obtain a representative population of sEV using FSC vs. side scatter (SSC) only. The flow cytometry-based isolation method not only allows for high-throughput analysis but also allows for synchronous classification or proteome analysis of sEV based on the biomarker expression, opening numerous downstream research applications.

This protocol provides a rapid and size-specific isolation method for small extracellular vesicles by optimizing the size of the air spray nozzle, sheath fluid pressure, sample flow pressure, voltage, gain, and triggering threshold parameters.

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Biochemie

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Tangential Flow-Ultrafiltration: Ein &quot;Green&quot;-Methode für die Größe Auswahl und Konzentration von kolloidalem Silber-Nanopartikel

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...