Dieses Protokoll ermöglicht eine direkte Abbildung der Neurofilamentpopulation in myelinierten Axonen von jugendlichen oder erwachsenen Mäusen mittels Fluoreszenzmikroskopie, wodurch es möglich ist, die Richtungs- und Geschwindigkeit des Neurofilamenttransports in isolierten Nervensegmenten zu messen. Diese Methode hängt von der Verfügbarkeit von Mäusen ab, die eine photoaktivierbare fluoreszierende Fusion des Proteins von Interesse ausdrücken, kann aber für den Einsatz in jedem leicht sezierten Nerv angepasst werden. Zunächst sauerstoffhaltige Saline in eine 60-Milliliter-Spritze gießen und sicherstellen, dass nur noch wenig Luft in der Spritze vorhanden ist.
Schließen Sie die Spritze an den Schlauch an, und legen Sie das Abflussrohr in einen Abfallkolben. Legen Sie die Äußere Dichtung in das Perfusionskammergehäuse, um sicherzustellen, dass die Ein- und Auslasspfosten mit den Löchern in der Dichtung ausgerichtet sind, legen Sie dann die Innendichtung auf eine Kreisförmige Abdeckung der Zahl 1,5 und glätten Sie sorgfältig alle Falten in der Dichtung, um eine enge Abdichtung zu gewährleisten. Legen Sie den Deckel und die Dichtung auf ein Papiertuch oder ein Aufgabentuch mit der Dichtung nach oben.
Verwenden Sie eine große Sezierschere, um einen dorsalen Schnitt in der Haut in der Nähe der Mitte der Wirbelsäule zu machen und weiterhin um den ventralen Aspekt des Tieres zu schneiden. Ziehen Sie die Haut langsam vom Muskel weg und schneiden Sie die Faszien. Als nächstes verwenden Sie Mikrodissektionschere, um einen Schnitt in den Oberschenkelmuskeln auf halbem Weg zwischen Schwanz und Knie zu machen, um den Ischiasnerv freizulegen.
Stellen Sie sicher, dass der Nerv, der durch den Muskel sichtbar ist, nicht geschnitten ist. Verlängern Sie den Schnitt dorsal und ventral, um den Muskel zu entfernen, dann entfernen Sie die Muskeln der Wade, halten Sie die Schnitte flach und kurz, um schädliche Nerven zu vermeiden. Entfernen Sie die Muskeln weiter, bis der Tibianerv vollständig von dem Punkt aus ausgesetzt ist, an dem er vom Ischiasnerv bis zur Ferse zweigt.
Greifen Sie den Tibianerv am proximalen Ende der Wirbelsäule mit einer Zange und schneiden Sie ihn mit einer Mikrodissektionsschere, um sicherzustellen, dass nicht zu viel Spannung auf den Nerv angewendet wird. Heben Sie es vorsichtig vom Muskel weg und schneiden Sie alle Befestigungen, wobei Sie darauf achten, keine Spannung auf den Nerv zu setzen. Schneiden Sie das distale Ende des Tibianervs der Wirbelsäule und übertragen Sie es auf eine kleine Petrischale mit Raumtemperatur mit Sauerstoffgehalt.
Ausgehend vom proximalen Ende des Nervs, greifen Sie vorsichtig die exponierten Axonenenden mit einem Paar sehr feiner Spitzenzange. Mit einem zweiten Zangenpaar die Nervenhülle proximal greifen und langsam zum distalen Ende des Nervs ziehen, um sicherzustellen, dass dabei keine übermäßige Spannung angewendet wird. Greifen Sie das proximale Ende des Nervs und legen Sie es langsam auf einen Deckelrutsch, dann richten Sie es unter sanfter Spannung.
Platzieren Sie den Mikroaquedukt-Dia über den Nerv mit dem gerillten Schlitten nach unten und positionieren Sie die Strömungsrichtung parallel zum Nerv. Drehen Sie die Deckelrutsch- und Mikroaquädukt-Baugruppe um und legen Sie sie in das Perfusionskammergehäuse mit der Rutsche gegenüber der Äußerendichtung. Um die Überflusskammer zu sichern, legen Sie sie in das Metallgehäuse und drehen Sie den Verriegelungsring.
Drücken Sie den Salinespritzenkolben langsam und füllen Sie die Perfusionskammer. Halten Sie den Ein- und Auslassschlauch, den Auslasskolben und die Spritze während des Aufbaus und der Bildgebung jederzeit über der Kammer selbst erhöht. Übertragen Sie die Profusionsbaugruppe auf eine invertierte Mikroskopstufe und montieren Sie die Salinespritze in die Spritzenpumpe, starten Sie dann den Motor und stellen Sie die Geschwindigkeit für eine Durchflussrate von 0,25 Milliliter pro Minute ein.
Schließen Sie die Inline-Lösungsheizung an und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Schließen Sie die Objektivheizung an und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Öl auf das Objektiv auftragen und die Profusionskammer in die Bühnenhalterung einsetzen.
Tragen Sie Öl auf das Kammerheizkissen auf und befestigen Sie es an der Perfusionskammer, schließen Sie es an und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius ein. Verriegeln Sie die Profusionskammer in den Bühnenadapter und bringen Sie das Objektivöl mit dem Deckelschlupf an der Unterseite der Kammer in Kontakt. Verwenden Sie Brightfield-Beleuchtung, um sich auf die Achselschicht auf der unteren Oberfläche des Nervs zu konzentrieren, der der Deckslipoberfläche am nächsten ist.
Myelinierte Axone können durch das Vorhandensein eines Myelinmantels identifiziert werden, der unter Brightfield-Lichtbeleuchtung ohne Kontrastverstärkung sichtbar ist. Erfassen Sie ein Brightfield-Referenzbild, das die Richtung des Nervs aufzeichnet, und erfassen Sie dann ein konfokales Bild mit einem 488-Nanometer-Laser und einem Emissionsfilter, der für photoaktivierbares GFP geeignet ist. Stellen Sie die Laserleistung auf etwa das Fünffache der normalen Bildleistung ein und erfassen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von drei bis vier Minuten, und erfassen Sie dann ein weiteres konfokales Bild, um die Autofluoreszenz vor der Aktivierung nach dem Bleichschritt aufzuzeichnen.
Zeichnen Sie eine Linie parallel zu den Axonen mit einer Länge, die der gewünschten Aktivierungsfenstergröße des Brightfield-Bildes entspricht. Zeichnen Sie diese Linie als Leitfaden über das Sichtfeld senkrecht zu den Axonen. Aktivieren Sie die GFP-Fluoreszenz in dieser Region durch Musteranregung mit dem 405-Nanometer-Licht, um sicherzustellen, dass ein Bild kurz vor und unmittelbar nach der Aktivierung aufgenommen wird.
Wenn die Aktivierung abgeschlossen ist, starten Sie einen 1-Minuten-Timer. Wenn es losgeht, beginnen Sie mit der Anschaffung einer Zeitrafferserie. Fügen Sie 250 Milligramm Fluoresceinpulver zu 0,5 Milliliter doppeldestilliertem Wasser hinzu und mischen Sie es, bis keine sichtbaren Partikel vorhanden sind, und drehen Sie die Lösung dann 30 Sekunden lang in einer Tischzentrifuge, um ungelöstes Material zu sedimentieren.
Fügen Sie acht Mikroliter Fluorescein-Lösung zu einem Dia hinzu und tragen Sie einen Deckelschliff mit der Nummer 1.5 auf. Die überschüssige Flüssigkeit abwischen, den Deckelrutsch mit Nagellack versiegeln und das Rutschen trocknen lassen. Platzieren Sie den Gleitdeckel seitlich nach unten auf der invertierten Mikroskopstufe und passen Sie den Fokus auf die dünne Fluoreszenzebene an der Oberfläche des Coverslips an.
Bewegen Sie die Folie um, um ein Sichtfeld zu finden, das keine Luftblasen oder große Fluoresceinpartikel enthält, und erfassen Sie einen Z-Stack, der sich in 0,2 Mikrometern-Intervallen über sechs Mikrometer erstreckt, sodass das mittlere Bild die ursprüngliche Fokusebene ist. Schließen Sie alle Lichtwegläden einschließlich des Kameraverschlusses und stellen Sie die Laserleistung und die Belichtungszeit auf null Sekunden ein. Erfassen Sie einen Stapel von 100 Bildern mit diesen Einstellungen, die gemittelt werden, um das Dunkelfeldbild zu generieren.
Repräsentative Bilder aus Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten werden hier gezeigt. Bei der Puls-Escape-Methode kann die Fluoreszenzzerfallskinetik in der aktivierten Region Informationen über das langfristige und kurzfristige Pausenverhalten liefern. Die aktivierte Region kann für diese Experimente kurz sein.
Für die Puls-Spread-Methode wird eine längere aktivierte Region verwendet, um einen größeren Pool fluoreszierender Neurofilamente bereitzustellen. Dies verlängert die Zeit, über die die Fluoreszenzzunahme in den flankierenden Regionen linear bleibt. Hier kommen 15 Mikrometer Flankenfenster zum Einsatz.
Die Gesamtfluoreszenz aus dem Messfenster wurde quantifiziert. Der Zerfall ist biphasisch für die Puls-Escape-Methode mit einem anfänglichen exponentiellen Zerfall, der die Abfahrt von On-Track-Neurofilamenten darstellt, und einem zweiten langsameren exponentiellen Zerfall bei 10 bis 20 Minuten, der die Abfahrt von Off-Track-Filamenten darstellt. Für die Puls-Spread-Strategie sind die Berechnungen der Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung nur von den Steigungen in den flankierenden Fenstern abhängig.
Bei den hier verwendeten Fensterlängen erstreckt sich die lineare Phase etwa fünf Minuten. Hier wird ein Zeitraffer eines glykolytisch gehemmten Nervs gezeigt, der eine offensichtliche Reduktion des Transports aus dem aktivierten Bereich zeigt. Tatsächlich sind die distalen und proximalen Neigungen bei Nerven, die mit Inhibitorbehandelt behandelt werden, signifikant niedriger.
Es gibt auch einen signifikanten Rückgang der Bevölkerungsgeschwindigkeit zwischen diesen beiden Bedingungen. Denken Sie beim Versuch dieses Protokolls daran, dass es entscheidend ist, die Sektions- und Kammermontageabschnitte voreilig durchzuführen, da die Nervengesundheit nach dem Opfer des Tieres abnimmt. Die neuronale Zellkultur kann die Messung und Analyse der Bewegung einzelner Neurofilamente ermöglichen, die die mit diesem Protokoll gesammelten Populationsskaladaten ergänzen würden.
