Diese Methode ermöglicht es, die Ubiquitylierung von EYFP-markiertem CENP-A-Protein zu identifizieren. Es kann auch auf menschliches CENP-A-Protein mit verschiedenen Tests und anderen Proteinen angewendet werden. Der Hauptvorteil besteht darin, dass es zur Identifizierung von EYFP CENP-A K124R allgegenwärtigen Standorten mit entscheidender biologischer Bedeutung verwendet werden kann.
Es könnte erweitert werden, um die post-translationalen Modifikationen einer breiten Palette von funktionellen Proteinen zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Herstellung von Protein A Perlen mit Anti-GFP-Antikörper gebunden. Waschen Sie 25 Mikroliter Protein A Perlen pro Immunpräzipitationsreaktion mit Puffer A1 mindestens dreimal, um das Ethanol zu entfernen.
Dann erstellen Sie eine 50%perlen Lösung mit Puffer A1. Fügen Sie zwei Mikroliter Anti-GFP-Antikörper zu den Perlen hinzu. Fügen Sie dann Puffer A1 bis das 20-fache des Netto-Perlenvolumens hinzu. Führen Sie die End-to-End-Rotation bei vier Grad Celsius für vier bis 18 Stunden durch.
Die optimale Dauer der Rotation muss empirisch anhand der Wirksamkeit der Immunpräzipitation bestimmt werden. Zentrifugieren Sie nach der Rotation die Perlen eine Minute lang mit 100 mal g und entfernen Sie den ungebundenen Überstand. Fügen Sie Puffer A1 hinzu, um eine 50%ige Lösung von Perlen zu machen und verwenden Sie 25 Mikroliter dieser Lösung für jede Immunpräzipitationsreaktion.
Um die Immunpräzipitation durchzuführen, Lysezellen in Puffer A1 durch Beschallung und Einfrieren/Tauen. Messen Sie die Proteinkonzentrationen und normalisieren Sie die Proteinmengen zwischen den verschiedenen IP-Proben. Entfernen Sie dann 5 % der Probe aus jedem Rohr, das auf der SDS-Seite ausgeführt werden soll.
Mischen Sie den Rest des Lysats mit 25 Mikroliterprotein A Perlen, die an Anti-GFP-Antikörper gebunden sind, und führen Sie eine End-to-End-Rotation bei vier Grad Celsius für vier bis 18 Stunden durch. Nach der Lysierung von Zellen in Puffer A und der Durchführung von Immunpräzipitation, wie zuvor beschrieben, halten Sie 10% der gesamten Immunpräzipitantien, um die EYFP CENP-A-Ubiquitylierung zu bestätigen und die Position des ubiquitylierten EYFP CENP-A genau zu bestimmen. Verwenden Sie die anderen 90 % für die Massenspektrometrieanalyse.
Führen Sie die Massenspektrometrieprobe in einem handelsüblichen 4-12%Bis-Tris-Proteingel aus. Führen Sie dann Coomassie blaue Färbung und Verbrauch die 50-70 Kilodalton Gel Region für Massenspektrometrie-Analyse. Jede Gelscheibe in kleine Stücke schneiden und in eine 0,5 Milliliter-Protein-Bindungsröhre geben.
Waschen Sie die Gelstücke mit 100 Mikroliter 50%Acetonitril in 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat. Wirbel sie für 10-15 Minuten. Dann drehen Sie sie nach unten und entsorgen Sie den Überstand.
Nach der letzten Wäsche die Gelstücke 30 Minuten lang mit einem Tischvakuumkonzentrator trocknen. 10 Mikroliter 10 Nanogramm pro Mikroliter Sequenzierung sezieren und die Gelstücke fünf Minuten rehydrieren lassen. Dann fügen Sie 25 Millimolar Ammonium bicarbonat, gerade genug, um die Gelstücke zu bedecken und verdauen sie bei 37 Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag den verdauten Überstand in ein sauberes 0,65 Milliliter Silikonrohr geben und 50% Acetonitril und 5%Ameisensäurelösung hinzufügen. Wirbeln Sie die Probe für 10 Minuten. Dann drehen Sie es nach unten und übertragen Sie den Überstand in ein Extraktionsrohr.
Konzentrieren Sie die Probe wieder auf zwei Mikroliter. Dann fügen Sie acht Mikroliter 3%Acetonitril und 2%Ameisensäurelösung hinzu. Wirbeln Sie es für 15 Minuten und drehen Sie es bei 16.000 mal g für 30 Minuten.
Führen Sie die MS-Datenerfassung mit LC-MS/MS mithilfe eines Flüssigchromatographiesystems in Verbindung mit einem Massenspektrometriegerät durch. Injizieren Sie acht Mikroliter der Probe in eine Flüssigchromatographiesäule der Umkehrphase und trennen Sie die Peptide mit einem Gradienten von 2-80% des Lösungsmittels B in 60 Minuten nach Manuskriptanweisungen. Sammeln Sie Massenspektrometriedaten mithilfe des datenabhängigen Erfassungsmodus.
Öffnen Sie die kommerzielle Software, um Massenspektrometriedaten auf dem Desktop zu analysieren. Um eine neue Suche zu starten, klicken Sie auf die LC-Schaltfläche im oberen Menü. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen, um die ursprünglichen MS-Rohdatendateien hochzuladen.
Wählen Sie die menschliche Protein-ID in der Paragon-Methode als Datenbanksuchmethode aus und durchsuchen Sie die ursprünglichen MS-Rohdatendateien mit der UniProt homo sapiens-Datenbank. Wählen Sie Trypsin als Verdauungsenzym und legen Sie den Rest der Parameter entsprechend den Manuskriptrichtungen fest. Geben Sie den Dateinamen der Ergebnisse ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern als rechts im Menü.
Wählen Sie dann einen Ordner zum Speichern der Suchergebnisse aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern. Klicken Sie auf die Prozessschaltfläche, um die Suche zu starten. Nach Dem Ende der Suche werden Daten mit dem eingegebenen Suchnamen automatisch im ausgewählten Ordner gespeichert.
Um MS/MS-Spektren eines bestimmten Peptids zu erhalten, öffnen Sie die Suchergebnisse in Software F.Dann klicken Sie auf das Protein in der Proteinliste im oberen Menü und klicken Sie auf das Peptid im mittleren Menü. Die MS/MS dieses Peptids werden unten im Menü angezeigt. Um die MS/MS-Spektren zu exportieren und zu speichern, kopieren Sie die Spektren und fügen Sie sie in ein geeignetes Dateiformat ein.
Genkonstrukte des EYFP CENP-A Wildtyps oder K124R-Mutanten, das den Verlust des endogenen CENP-A rettet, wurden bei der retroviralen Integration stabil ausgedrückt. Die Expression der endogenen CENP-A wurde sieben Tage nach der Induktion der Cre-Rekombination nicht nachgewiesen. Sowohl eyFP CENP-A Wildtyp und K124R Proteinexpression wurde gefunden, um auf einem ähnlichen Niveau wie das ursprüngliche endogene CENP-A Protein zu sein.
Sowohl EYFP CENP-A Wildtyp als auch K124R-Mutanten zeigten sieben Tage nach der Störung der verbleibenden Expression des endogenen CENP-A eine Zentromerlokalisierung. Der EYFP CENP-A Wildtyp und der K124R Mutant zeigten Ubiquitylierung und Interaktion mit HJURP im Gegensatz zu gekennzeichneten markierten oder nicht markierten CENP-A-Wild-Typen und dem K124R-Mutanten. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch die Durchführung des Kolonie-Auswuchs-Assays 14 Tage nach der Störung des verbleibenden endogenen CENP-A-Alleels bewertet.
Sowohl EYFP CENP-A Wildtyp und K124R Mutanten zeigten eine ähnliche Anzahl von geretteten Kolonien 14 Tage nach der Störung der verbleibenden endogenen CENP-A Allel. Die IP-Massenspektrometrie zeigte die Ubiquitylierung bei Lysin 306 in EYFP CENP-A K124R in CENP-A minus F-Zellen. Insgesamt deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Fusion von großformatigem Protein eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin als K124R in CENP-A induziert, was den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp hemmt.
Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, verwenden Sie die handelsüblichen 4%12%Bis-Tris Proteingele, um die Massenspektrometrieproben auszuführen. Fügen Sie den Gelstücken ausreichend Trypsin hinzu und rehydrieren Sie sie, bis alle Enzyme absorbiert sind. Eine niedermolekulare Tagging- oder Sondierungstechnik ist tatsächlich erforderlich, um die Ubiquitylierung zu visualisieren und die räumliche zeitliche Protein-Ubiquitylierung auf der und der gesamten Organismusebene zu untersuchen.
