Wir beschreiben eine effiziente Methode der oligodendroglialen Linienzellen Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zur Steuerung der Differenzierung von Oligodendrozyten und deren Wechselwirkungen mit Neuronen während des Myelinnationsprozesses zu adressieren. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer und optimal, um eine hohe Menge an Oligodendrozyten zu erhalten.
Solche Kulturen ermöglichen die Produktion von Oligodendrozyten-konditionierten Medium und Ko-Kulturen von Oligodendrozyten mit Neuronen. Multiple Sklerose ist eine Krankheit, die durch fokale De-Myelination im zentralen Nervensystem verursacht wird, sekundär zu Oligodendrozyten Verlust. Oligodendrozyten Kultur bieten ein Werkzeug für ein besseres Verständnis, wie re-Myelination zu fördern.
Nur oligodendrogliale Zellkultur könnte Einblicke in intrinsische Mechanismen geben, die Entwicklungen und Biologie von Oligodendrozyten regulieren. Ko-Kulturen mit Neuronen ermöglichen es, Einblicke in ihre Auswirkungen auf die neuronale Physiologie zu gewinnen. Verwenden Sie zunächst gekrümmte Zangen, um den Kopf des Tieres auf Augenhöhe zu halten.
Verwenden Sie kleine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt an der Schädelbasis zu machen und schneiden Sie den Schädel nach der Gehirnmittellinie. Verwenden Sie Zangen, um die beiden Teile des Schädels sanft von der Mittellinie abzuziehen. Verwenden Sie einen kleinen chirurgischen Löffel, um das Gehirn aus der Kopfhöhle zu entfernen.
Setzen Sie das Gehirn in eine 60-Millimeter-Petrischale mit eiskaltem PBS-Glukose auf Eis. Betrachten Sie unter einem Stereomikroskop, verwenden Sie feine Zange, um das Kleinhirn, den Hirnstamm und die olfaktorischen Glühbirnen aus den zerebralen Hemisphären zu entfernen. Verwenden Sie feine Zangen, um die beiden zerebralen Hemisphären zu trennen.
Verwenden Sie feine Zange, um die Meninges abzuschälen. Die Zerebralparese in einer 60-Millimeter-Petrischale auf Eis legen. Verwenden Sie in einer laminaren Fließhaube ein scharfes Skalpell, um die Zerebralparese fein zu hacken.
Übertragen Sie das gehackte Gewebe in eine 50-Milliliter-Röhre, die Enzymverdauungsmedium enthält. Inkubieren Sie für 30 Minuten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Danach verwenden Sie eine Pipette, um das Enzymverdauungsmedium sanft zu entfernen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das kortikale Gewebe am Boden des Rohres verbleibt.
Verwenden Sie eine P1000 Mikropipette, um einen Milliliter DMEM 10%fetales Kalbsserum hinzuzufügen und das Gewebe sanft zu trituieren. Verwenden Sie einen 70-Mikron-Filter und den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, um das Kortikalgewebe in ein 50-Milliliter-Rohr zu filtern. Spülen Sie das Restgewebe an der inneren Rohrwand des 50-Milliliter-Rohrs mehrmals mit DMEM 10%fetalem Kalbsserum.
Füllen Sie das 50-Milliliter-Rohr mit DMEM 10%fetales Kalbsserum. Zentrifuge bei 423 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Zellpellet mit zwei MilliliterDMEM 10% fetalem Kalbsserum wieder auf.
Das Zellpellet vorsichtig mit der Mikropipette P1000 und dann mit der P200-Mikropipette trituieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem entsprechenden Volumen von DMEM 10%fetales Kalbsserum. Platte fünf Milliliter der Zellsuspension auf einem T-150 Kolben mit einer Dichte von ein mal 10 bis fünf Liter pro Quadratzentimeter.
Fügen Sie 20 Milliliter warmes DMEM 10%fetales Kalbsserum zu jedem T-150 Kolben hinzu. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Nachdem sie die Probe über Nacht bei 250 U/min und 37 Grad Celsius geschüttelt hat, ernten Sie den Überstand im Kolben, der hauptsächlich Oligodendrozyten-Linienzellen, aber auch einige mikrogliale Zellen enthält, und auf unbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen aufsieben.
Die Petrischalen 15 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bebrüten. Dies ermöglicht die Entfernung von mikrogliaalen Zellen durch differenzielle schnelle Haftung auf der Telleroberfläche. In der Zwischenzeit jeden T-150 Kolben mit 25 Milliliterwarmem, frisch zubereitetem Kulturmedium füllen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid bis zum zweiten Schütteln brüten.
Als nächstes übertragen Sie den Überstand aus den Petrischalen in neue unbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen, um die Haftung von verbleibenden Mikroglialzellen zu ermöglichen. Die Petrischalen 15 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid bebrüten. Entfernen Sie den Überstand aus allen zwei Petrischalen, die nicht haftende Oligodendrozyten-Linienzellen enthalten, und übertragen Sie ihn in eine 50-Milliliter-Röhre.
Entsorgen Sie die mit Mikroglia überzogenen Petri-Gerichte. Zentrifugieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei 423 mal g. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Zellpellet mit einem Milliliter Bottenstein-Sato-Medium wieder auf.
Bündeln Sie alle Pellets in einem gemeinsamen 50-Milliliter-Rohr und stellen Sie das Volumen je nach Zelldichte mit Bottenstein-Sato-Medium auf 20 oder 30 Milliliter ein. Platte zwei oder drei vorbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen mit 10 Millilitern der Zellsuspension. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid.
Zwei Stunden später, löschen Sie die Trümmer aus den Petri-Gerichten, indem Sie das gesamte Bottenstein-Sato-Medium erfrischen. Inkubieren Sie für zwei Tage im Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Nach zwei Tagen, untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop.
In einer laminaren Durchflusshaube, unter sterilen Bedingungen, erneuern Sie das Kulturmedium mit 10 Milliliter nwarmmp-27 low medium. Inkubieren Sie für zwei Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Um das OCM zu ernten, sammeln Sie den Überstand, der Oligodendrozyten enthält, die von den Sezern zerseitierten Faktoren werden.
Filter sterilisieren sie den OCM mit einem 0,22-Mikron-Filter. In diesem Protokoll wurden Oligodendrozyten-Linienzellen aus Gliakulturen gereinigt, indem Astrozyten und Mikroglia abgeschüttelt wurden. Die Analyse der Expression verschiedener Marker ergab, dass Oligodendrozytenkulturen meist Voroligodendrozyten mit 90 plus oder minus 4% der O4-positiven Zellen, 85 plus oder minus 7%NG2-positiven Zellen und 4,7 plus oder minus 2,1% der PLP-positiven Zellen waren, während 7,2 plus oder minus 2,5% der Zellen GFAP-positive Astrozyten waren.
OCM, das aus solchen Kulturen hergestellt wurde, wurde an drei Tagen in vitro zu gereinigten Hippocampus-Neuronkulturen hinzugefügt. Diese Behandlung fördert die Clusterbildung von Notalproteinen. Die Myelinisierung von Hippocampus-Neuronen wurde durch Zugabe von Oligodendroctyes nach 14 Tagen in vitro untersucht.
Von 20 bis 24 Tagen in vitro ermöglichte die Immunfärbung von Myelinmarkern wie Myelin-Basisprotein die Visualisierung der Myelinsegmente und Knoten von Ranvier. Core PBS ist wichtig für Meninges Entfernung. Das lebhafte Clearing ist entscheidend für die Oligodendroctyes-Lebensfähigkeit und die Realisierung der Stärken des mit der Pipette aufgebrachten Durchflusses.
Oligodendrozyten-konditioniertes Medium kann neuronalen Kulturen hinzugefügt werden, um Einblick in die Auswirkungen von oligodendroctyes sezernierten Faktoren auf die neuronale Physiologie zu gewinnen. Ko-Kulturen von Oligodendrokty mit Neuronen können auch durchgeführt werden, um den Myelinationsprozess zu studieren.
