Diamond ist die erste Open-Source-Methode zur quantitativen Bewertung der vierdimensionalen segmentalen Herzfunktion in Zebrafischembryonen. Unsere Methode hat eine Mikrometerauflösung, die lokale Herzmechanik im 3D-Raum quantifizieren kann. Kein anderer aktueller Ansatz lässt dies zu.
Diamant entwirrt neuartige Verletzungsmuster bei Doxorubicin-induzierter Herztoxizität. Daher glauben wir, dass unsere Methode als Plattform für ein In-vivo-Screening mit hohem Durchsatz für chemotherapieinduzierte Kartotoxizität eingesetzt werden könnte. Wir arbeiten derzeit daran, Diamond an das Säugetierherz anzupassen.
Jedoch, zusätzliche Arbeit ist notwendig, um Säugetier Herz Muskelfaser Orientierung und Rotation und Verdrehung Bewegung zu berücksichtigen. Beim Versuch dieser Methode ist es sehr wichtig, dass der Benutzer eine klare Visualisierung der anatomischen Struktur des Zebrafischherzens hat, um die horizontale und die vertikale Achse korrekt zu identifizieren und den Ventrikel zu segmentieren. Um das systolische und diastolische 3D-Herz zu rekonstruieren, öffnen Sie zunächst den Ordner, der vom Nachsynchronisierungsalgorithmus erstellt wurde, und öffnen Sie dann den Ausgabeordner.
Suchen Sie die erste systolische und diastolische Phase und zeichnen Sie die Framenummer auf. Öffnen Sie dann die Ausgabe nach Statusordner, und suchen Sie die Ordner, die die gleichen Zahlen wie die aufgezeichneten Framenummern haben. Konvertieren Sie die Bilder im Ordner in 3D-TIF-Dateien und nennen Sie sie diastole.
tif und systole.tif. Um die Segmentierung des Ventrikels durchzuführen, öffnen Sie die Bildanalysesoftware, indem Sie auf Datei klicken und Daten öffnen. Dann diastole laden.
tif und systole. und geben Sie die Voxelgröße entsprechend den Bildeinstellungen ein. Klicken Sie auf das Segmentierungsfeld, und segmentieren Sie den Herzkammerteil manuell mit dem integrierten Schwellenwerkzeug.
Entfernen Sie dann den atrioventrikulären Kanal und den Abflusstrakt in der segmentierten Herzkammer, da dies die Verschiebungsanalyse beeinflusst. Nachdem die Segmentierung abgeschlossen ist, klicken Sie auf das Projektfenster, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die diastole.labels. tif und systole.labels.
tif-Registerkarten in der Konsole und klicken Sie auf Daten exportieren, um die Daten als 3D-TIF-Dateien zu speichern. Öffnen Sie prepimage_1. m stellen Sie in der Programmierumgebung sicher, dass der Ordner in InPath in Zeile 5 die ursprünglichen und segmentierten TIF-Dateien enthält, und ändern Sie Slices auf Live-Vier in die Anzahl der Slices der 3D-TIF-Dateien.
Nach dem Ausführen des Codes werden fünf neue 3D-TIF-Dateien und zwei neue Ordner generiert. Importieren Sie alle fünf 3D-TIF-Dateien in die Bildanalysesoftware. Wechseln Sie zum Multiplanar-Panel und wählen Sie diastole_200 aus.
tif als primäre Daten. Richten Sie die x-Achse an der vertikalen langen Achse des Ventrikels und der Z-Achse an der horizontalen langen Achse des Ventrikels aus. Als Nächstes wählen Sie drei Zufällige Punkte aus der schrägen YZ-Ebene gegen den Uhrzeigersinn aus und zeichnen ihre 3D-Positionskoordinaten auf.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für systole_200.tif. Klicken Sie auf das Projektfenster, und erstellen Sie ein Slice-Objekt für diastole_200. tif durch Rechtsklick auf diastole_200.
tif und suchen Sie nach dem Slice-Objekt. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das erstellte Slice-Objekt, überprüfen Sie die Festgelegtebene in den Optionen für das Eigenschaftenbedienfeld, wählen Sie drei Punkte in der Ebenendefinition aus, und geben Sie die zuvor aufgezeichneten Koordinaten ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf diastole_200.
tif, suchen Sie nach resample transformierten Bild und erstellen Sie das Objekt. Wählen Sie im Eigenschaftenbedienfeld Slice als Referenz aus, und klicken Sie auf Anwenden, das ein Objekt mit dem Namen diastole_200.transformed generieren soll. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf diastole_200.
transformiert, suchen Sie nach resample und erstellen Sie das Objekt. Wählen Sie voxel Größe als Modus und ändern Sie es in x gleich eins, y gleich eins, und z gleich eins im Eigenschaftenbedienfeld. Klicken Sie auf Anwenden, und speichern Sie dann die generierte diastole_200.
resampled Objekt als 3D-TIF-Datei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für dialabel. tif, testen.
tif, systole_200. tif, syslabel. tif und testen.
tif nach den Manuskriptanweisungen. Importieren Sie alle sechs neu gesampelten Dateien in ImageJ, und wählen Sie das Segment systole_200 aus. resampled, in dem der atrioventrikuläre Kanal klar visualisiert ist, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Scheibe aufzeichnet.
Verwenden Sie die Bildtransformationsdrehfunktion, um den atrioventrikulären Kanal vertikal zu positionieren. Wenden Sie dieselbe Drehung auf alle Dateien an, schließen Sie dann alle Fenster, und speichern Sie die Änderungen. Bewegen Sie als Nächstes systole_200.
resampled, syslabel. resampled und test2. in den Ordner resample_sys.
Verschieben Sie diastole_200. resampled, dialabel. resampled, und testen.
in den Ordner resample_dia. Öffnen Sie divider_2_8_pieces. m und ändern Sie InPath in Zeile 5 in das Bildverzeichnis.
Ändern Sie die variable Mitte in Zeile 22 in die Scheibenzahl, wo der atrioventrikuläre Kanal klar visualisiert ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang für diastole_200. auf den Linien 394 und 411.
Führen Sie den Code aus. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie einmal auf die Mitte des Ventrikels und auf die Mitte des atrioventrikulären Kanals. Um systolische und diastolische Bildmatrizen zu registrieren, öffnen Sie register_3.
m und ändern Sie InPath in Zeile vier in den Bildordnerpfad. Öffnen Sie dann displacement_4. m und ändern Sie InPath in den Bildordnerpfad.
Führen Sie das Programm aus, um einen Vektor zu generieren8. txt-Datei mit einer Acht-mal-Vier-Matrix. Jede Zeile der Matrix enthält die Größen der x-Komponente, y-Komponente, z-Komponente und die Summe des Verschiebungsvektors eines bestimmten Segments des Ventrikels.
Diese Werte können dann in eine Kalkulationstabelle übertragen werden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um segmentale Heterogenität der Herzfunktion und Anfälligkeit für Doxorubicin-induzierte Myokardverletzungen bei Zebrafischen aufzudecken. Nach einer 24-stündigen Doxorubicin-Behandlung von drei auf vier nach der Befruchtung wurde die Verschiebung ventrikulärer Segmente zwischen Kontroll- und behandelten Gruppen verglichen.
Unter Kontrollbedingungen erleiden die Basalsegmente eins und sechs die größten Verschiebungen und sind die am stärksten anfällig für Doxorubicin-induzierte Herzverletzungen. Bei sechs dpf lag die durchschnittliche L2-Norm der Segmentverschiebungsvektoren in den Kontrollfischen nach der Normalisierung zwischen 3,9 und 8%. Die Basalsegmente eins und sechs erholten sich diamantverdrängung zu Kontrollebenen, die auf eine segmentale Regeneration hindeuten.
In der Zwischenzeit wurde eine Verschlechterung der 2D-Basalbelastung von negativen 53 auf negative 38% unmittelbar nach der Doxorubicin-Behandlung beobachtet, gefolgt von einer Rückkehr auf Kontrollniveaus 48 Stunden später, die die Diamond-Verschiebungsergebnisse bestätigt. Eine parallele Abnahme und Erholung der globalen Auswurffraktion oder EF als Reaktion auf die Behandlung wurde ebenfalls beobachtet. Diamant wurde dann während der Doxorubicin-Behandlung und Kerbwegmodulation mit dem Kerbinhibitor DAPT und den nachgeschalteten Effektoren NICD und NRG1 mRNA angewendet.
Die mRNA-Mikroinjektion rettete die Abnahme der Diamantverschiebung und EF nach akuter Chemotherapie-induzierter Verletzung. Darüber hinaus behinderte die Hemmung des Kerbwegs nach der Chemotherapie die Rückgewinnung der Diamantverschiebung der Basalsegmente und EF 48 Stunden nach der Behandlung, aber die Hemmung wurde durch die Kerbe nachgeschalteten Effektoren gerettet. Traditionelle Auswurffraktion ist bekannt, ein unsensibler und verzögerter Indikator für Myokardverletzungen zu sein.
Diamond ermöglicht es Forschern, die fokale Herzfunktion zu quantifizieren und die Heterogenität bei Myokardverletzungen bei Zebrafischembryonen zu unterstützen.
