Die weit verbreitete Sonde CFDA, kurz für Carboxyfluorescein-Diacetat, ist nicht fluoreszierend. Die beiden H3-Gruppen und die 3'6'Position auf dieser Verbindung machen sie membranpermeant. Wo einmal in den Zellen, interne zelluläre Acetate werden die Acetat-Gruppen entfernen und die neue Form von CFDA freisetzen.
Das ist ein Carboxyfluorescein, oder das CF, das fluoreszierend ist. Und weil diese neue Form weniger membranpermeant ist, das Gewicht, alle Zellen sollen sich durch die interzellulären Poren oder die Plasmodesmata in Pflanzen bewegen, das macht dieses Diacetat zur idealen Sonde, um den interzellulären Transport in Phloemaktivität zu untersuchen. Im heutigen Video werden wir die CFD-Belastung in die Wurzel bzw. Hypocotyl der Arabidopsis-Pflanzen demonstrieren, und wir werden zeigen, wie sich die beiden leicht unterschiedlichen Verfahren auf die Bewegung von unten nach oben dieser fluoreszierenden Sonde auswirken.
Erzielen Sie die Färbung Ergebnisse konsequent, speichern wir die geernteten Arabidopsis Samen in vier Grad Celsius, 40% Feuchtigkeit Schrank. Neu geerntete Samen, die in diesem Zustand für mehr als sieben Tage gelagert werden, werden leicht für die Aussaat verwendet. Um sicherzustellen, dass jede Pflanze in einem relativ ähnlichen Raum in der Petrischale angebaut wird, verwenden wir eine Samenzonenkarte.
Jetzt die sterilisierte Spitze benetzen, in die sterilisierten Samen eintauchen und die Samen einsaimmern nacheinander auf der vorgesehenen Position. Nach der Aussaat die Petrischale mit Parafilm und Klebeband versiegeln, auf einen Petrischalenständer legen, damit sie vertikal wachsen kann. Hier sind die Werkzeuge, die wir in diesem Experiment verwenden werden.
Bitte beachten Sie, dass wir den Farbstoff besser so schnell wie möglich laden sollten. Normalerweise beenden Sie den gesamten Prozess in 10 bis 15 Minuten. Bevor wir das CFDA-Ladeexperiment durchführen, bereiten wir immer eine frische CFDA-Lösung vor.
Hierbei die ein Millimolar CFDA vor dem sofortigen Gebrauch in fünf Mikromolarkonzentrationen mit Wasser verdünnen. Schneiden Sie den Parafilm in kleine Stücke in drei mal drei Millimeter Größe. Da es Kondensation auf dem Deckel und boden der Petrischale gibt, müssen wir sie mit Papiertuch ausräumen, um zu vermeiden, dass Farbstoff herumfließt.
Ein kleines Parafilmstück wird unter die Wurzel gelegt. Heben Sie die Pflanzen an und legen Sie sie auf den Deckel. Schneiden Sie die Wurzeln etwa fünf bis zehn Millimeter unter dem Hypocotyl.
Nehmen Sie die Triebe zurück auf die kleinen Stücke von Parafilm. Tragen Sie nun vorsichtig einen Mikroliter CFDA auf das Schneidende der Wurzel auf. Versuchen Sie, eine Kontamination aller Protopflanzen zu vermeiden.
Dann den Deckel bedecken und dann für zwei Stunden im Wachstumsraum lassen. Die Hypocotyl-Pinching-Methode. Das kleine Parafilmstück wird, wie bisher vorbereitet, unter die Wurzel-Hypocotyl-Kreuzung gestellt.
Wir verwenden ein Forecep, um das Hypocotyl vorsichtig in der Nähe des Wurzelgewebes zu kneifen, und tragen sorgfältig 0,1 Mikroliter CFDA auf die eingeklemmte Seite auf und lassen die Pflanze für zwei Stunden. Die Fotos von neun bis zwölf Tage nach Zonenfärbepflanzen. Sie alle zeigen das vaskuläre Färbungsmuster sowohl in den Kotyledonen als auch in den wahren Blättern.
Nur in einem sehr seltenen Fall zeigte das Cotyledonblatt ein halbblättriges Färbungsmuster. Im Grunde haben die beiden Methoden also keinen Unterschied im CF-Färbemuster gemacht, aber wenn wir Farbstoffe in immer mehr Pflanzen laden, stellen wir fest, dass die beiden Verfahren einen signifikanten Unterschied in der Effizienz ergeben. Mit der Root-Cut-Methode zeigen etwa 70% der Pflanzen das fluoreszierende Signal im Trieb.
Aber die Effizienz kann mit der Hypocotyl-Pinching-Methode auf 91% erhöht werden. Wir haben auch die Root-Pinching-Methode ausprobiert, aber diese Methode führt zu einer noch geringeren Effizienz, es ist etwa 30%Daher scheint es der Weg, den Farbstoff zu laden, nicht für die Färbung Unterschied zu berücksichtigen. Der Unterschied liegt höchstwahrscheinlich in den Verladestellen, die durch eine symplastische Barriere getrennt werden könnten.
Wir zeigten, wie wir die CFDA in die Arabidopsis-Wurzeln und Hypocotyl laden. Wir haben zwei leicht unterschiedliche Verfahren verwendet, und diese beiden leicht unterschiedlichen Verfahren führen zu signifikanten Unterschieden in dieser unteren bis oberen Sondenbewegung. Wir schlagen vor, dass diese Methode uns helfen könnte, eine potenzielle symplastische Barriere für wurzelabgeleitete Triebsignale zu identifizieren.
