Dieses Protokoll zeigt, dass es möglich ist, neuartige Neuronen direkt im Gehirn aus der ansässigen Glia zu erzeugen und dass diese umprogrammierten Zellen zu subtypspezifischen Neuronen reifen. Der Hauptvorteil ist das kre-abhängige AAV-Virus, das eine gezielte Ausrichtung des NG2-Glia und des GFP-Reporters ermöglicht, der die neu programmierten Neuronen für die Analyse kennzeichnet. Die Erzeugung neuer Neuronen im Gehirn kann zu einer zukünftigen Entwicklung für Zellersatztherapien im Gehirn führen.
In unserem Protokoll erzeugen wir die parvalbumin-positiven Interneurons, die Auswirkungen auf psychiatrische Störungen haben. In vivo Reprogrammierung kann auf andere Gehirnbereiche und Schaltkreise angewendet werden, je nachdem, welchen neuronalen Phänotyp und neurologischen Zustand Sie ansprechen möchten. Die Vorführung des Verfahrens wird Jenny Johansson sein: eine Technikerin, Maria Pereira: eine ehemalige Doktorandin und Marcella Birtele: eine Doktorandin in unserem Labor.
Um AAV5 viralen Vektor zu produzieren, Säen HEK293T Zellen mit Standard-Kulturmedium in fünf T175-Kolben. Wenn die Zellen 50 bis 70% Konfluenz erreichen, bereiten Sie die folgende Mischung für die Transvtion vor. In einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr, fügen Sie gleiche molare Mengen an Vektorplasmid, und pDG-Serie Helfer-Plasmid.
Fügen Sie Tris-EDTA Puffer zu einem Endvolumen von 144 Mikrolitern hinzu und fügen Sie dann reines Reinstwasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1296 Mikrolitern zu erzielen und zu mischen. Als nächstes 144 Mikroliter 2,5 Molcalciumchlorid hinzufügen und mischen. Danach 1,92 Milliliter HBS sofort in die DNA-Lösung und Wirbel geben.
Bei Raumtemperatur genau 60 Sekunden inkubieren. Anschließend die Lösung auf 28 Milliliter Frischzellenkulturmedium übertragen und mischen. Ersetzen Sie das Medium in den Kolben durch das Medium, das eine Transvection-Mischung enthält.
Warten Sie drei Tage, und übertragen Sie die Medien in die Verschwendung. Fügen Sie jedem Kolben fünf Milliliter Erntepuffer hinzu, und fügen Sie dann weitere vier Milliliter DPBS zu jedem Kolben hinzu, um die verbleibenden Zellen zu spülen und mit der Zelllösung zu poolen. Zentrifugieren Sie die geernteten Zellen bei 1.000 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen und das Pellet in 15 Milliliter Lysepuffer auflösen. 50 Milliliter Zentrifugenrohr 15 Minuten auf Trockeneis einfrieren und in einem Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius aufbewahren. Vor gebrauchen die geerntete Zelle in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen.
Führen Sie bei diesem Verfahren die AAV-Reinigung durch Iodixanolgradientenultrazentrifugierung durch und verwenden Sie ultrazentrifugierte Deckenrohre mit Zentrifugation bei 350, 000 x g für eine Stunde und 45 Minuten bei Raumtemperatur. Um die AAV-haltige Phase zu extrahieren, legen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Meter-Nadel etwa zwei Millimeter unter der 40 bis 60%igen Phasengrenze mit der Abschrägung nach oben und ziehen Sie sich zurück. Achten Sie darauf, vor Erreichen des Proteinbandes zu stoppen, nachdem fünf bis sechs Milliliter des viralen Vektors extrahiert wurden.
Dann reinigen und konzentrieren Sie den verdünnten Iodixanol-Gradienten durch einen Anionenaustauschfilter, indem Sie ihn mit einer Rate nicht schneller als einen Tropfen pro Sekunde durchdrücken. Anschließend drei Milliliter IE-Puffer langsam durch den Filter schieben, um ihn zu waschen. Als nächstes wird die Mischung in eine Zentrifugalfiltereinheit mit einem bis zwei Milliliter Elutionspuffer eingebracht.
Fügen Sie dem Gerät DPBS zu einem Endvolumen von vier Millilitern hinzu. Zentrifuge bei 2.000 x g bei Raumtemperatur, bis weniger als 0,5 Milliliter DPBS im Filter verbleiben. Danach entfernen Sie Flüssigkeit von der Unterseite des Rohres, nachfüllen mit vier Milliliter DPBS, und Zentrifuge wieder.
Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Weitere Male, stellen Sie sicher, dass das Volumen des konzentrierten Vektors auf dem Filter etwa 200 Mikroliter nach der letzten Zentrifugation beträgt. Entfernen Sie den 200 Mikroliter konzentrierten Vektor mit einer Pipette und drücken Sie ihn durch einen 0,22 Mikrometer Filter, um ihn zu sterilisieren. Als nächstes aliquot 200 Mikroliter in eine Glasfläschigkeit mit verriegelten Einsatz.
Um Reprogrammierungsfaktoren zu injizieren, legen Sie eine anästhesierte Maus in den stereotaxic-Rahmen. Verabreichen Sie eine entsprechende Analgesie zu Beginn der Operation, dann bringen Sie die Spitze der Glaskapillare der Injektionsnadel knapp über Bregma. Stellen Sie sicher, dass die Kapillarspitze sowohl in A-P- als auch in M-L-Ebenen perfekt gerade ist.
Setzen Sie sowohl die M-L- als auch die A-P-Werte auf 0,0 auf dem digitalen Koordinatenzähler zurück. Um sicherzustellen, dass sich der Kopf des Tieres in einer vollkommen flachen Position befindet, verwenden Sie den digitalen Koordinatenzähler, um den D-V-Koordinatenwert zu messen, wenn der A-P-Arm bei plus 2,0 und minus 2,0 ist und wenn der M-L-Arm bei plus 2,0 und minus 2,0 liegt. Passen Sie die Höhe der Zahnstange und der Ohrstangen entsprechend an.
Danach heben Sie die Spritze leicht an und bohren Sie ein Loch mit einem Zahnbohrer an den Injektionskoordinaten. Beginnen Sie, auf der Website zu bohren, arbeiten in einer kreisförmigen und sanften Art und Weise. Legen Sie dann ein Stück Watte über den offenen Einschnitt und spülen Sie die Spritze mit einer Salinelösung.
Nach dem Spülen eine Luftblase und dann einen Mikroliter Lösung mit dem viralen Vektor aufstellen. Stellen Sie sicher, dass die virale Lösung leicht unter der Luftblase visualisiert werden kann. Senken Sie als Nächstes die Spritze, bewegen Sie sich langsam in die gewünschte Tiefe, und stellen Sie sicher, dass die Flugbahn frei von Knochenfragmenten ist.
Anschließend einen Mikroliter der viralen Lösung mit einer Rate von 0,4 Mikroliter pro Minute injizieren. Wenn die Injektion durchgeführt ist, lassen Sie zwei Minuten für die Diffusion vor spritzenEntzug. Nach der Diffusion die Spritze langsam zurückziehen, bis die Spitze der Kapillare vollständig aus dem Gehirn zurückgezogen wird, dann den Schnitt vorsichtig vernähen und das Tier aus dem stereotaxic Rahmen entfernen.
Überwachen Sie das Tier in einer postoperativen Station, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Tiere werden bis zu 12 Wochen nach der Virusinjektion gehalten, damit die ansässige Glia in reife Neuronen umprogrammieren kann. Um Gehirnscheiben für die Elektrophysiologie mit einem Vibratom vorzubereiten, schneiden Sie das Gehirn vom rostralsten Teil bis zum striatalen Niveau mit hoher Geschwindigkeit.
Dann das Striatum koronal bei 275 Mikrometern bei 0,1 Millimetern pro Sekunde abschnitt. Nach jedem Abschnitt entfernen Sie vorsichtig die nicht injizierte sttriatale Seite und übertragen Sie die injizierte Seite in eine Durchstechflasche mit einem unteren Netz und sauerstoffhaltigem CREB-Sinnrutsch im Wasserbad bei Raumtemperatur. Bewahren Sie die Durchstechflasche bei Raumtemperatur auf, bis alle Abschnitte geschnitten sind.
Danach, langsam erhöhen Sie die Temperatur des Wasserbades auf 37 Grad Celsius und lassen Sie es für 30 Minuten, dann schalten Sie die Heizung und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Nach der Übertragung eines Gewebeabschnitts in eine Aufnahmekammer für die Elektrophysiologie die Glaspipette auf die Aufnahmeelektrode montieren und in die Lösung senken. Überprüfen Sie den Widerstand der Elektrode.
Dann nähern Sie sich langsam der umprogrammierten Zelle mit der Pipette, halten einen leichten positiven Druck in der Elektrode, um das Schließen der Spitze zu vermeiden, und überprüfen Sie, ob die Zelle GFP-positiv ist, bevor Sie patchen. Wenn die Zelle gepatcht ist, halten Sie die Zelle in stromstromklemme von minus 60 bis minus 70 Millivolt, und injizieren Sie 500 Millisekundenströme von minus 20 bis plus 90 Picoamperen mit 10 Picoampere-Schritten, um Aktionspotenziale zu induzieren. Dies ist ein Hinweis auf eine neuronale Reifung und eine erfolgreiche Neuprogrammierung.
Anschließend schalten Sie auf Spannungsklemme um und messen Das nach innen gerichtete Natrium und verzögerte Korrektur von Kaliumströmen bei Depolarisationsschritten von 10 Millivolt. Hier ist ein postaufgezeichnetes Biocytin gefüllt es neu programmiertes Neuron, das reife neuronale Morphologie und die dendritischen Stacheln zeigt. Hier zeigen elektrophysiologische Aufnahmen der umprogrammierten Neuronen das Vorhandensein postsynaptischer funktioneller Verbindungen mit spontanen Aktivitätsmaßnahmen.
Spuren zeigen die hemmende Aktivität, die mit Picrotoxin blockiert ist, einem GABAA-Rezeptor-Antagonisten und der erregenden Aktivität, die mit CNQX, einem AMPA-Rezeptor-Antagonisten, blockiert ist. Die geflickten Neuronen zeigen bereits postsynaptische Aktivität bei fünf Wochen nach der Injektion, und setzen sich bei acht und 12 Wochen nach der Injektion fort. Die Anzahl der Neuronen mit aktuellen induzierten Wirkungspotentialen steigt auch im Laufe der Zeit.
Eine detailliertere Analyse ergab mehrere unterschiedliche Brennmuster, bei denen die Mehrheit der Zellen eine schnelle Spiking-Aktivität ähnlich wie Parvalbumin interneurons zeigt. Die immunhistochemische Analyse nach 12 Wochen zeigte die Ko-Expression des Reporters GFP und des Parvalbumins. Nach diesem Verfahren können Sie die Genexpression mit Patch-Seek-Technik untersuchen oder die dreidimensionale synaptische Konnektivität mit monosynaptischer Tracing und iDISCO bewerten.
Nun, da es möglich ist, Resident Glia in Parvalbumin auszudrücken interneurons umzuprogrammieren, haben wir begonnen zu untersuchen, ob diese authentisch sind und als therapeutisches Werkzeug verwendet werden können. Denken Sie daran, die festgelegten Protokolle und Richtlinien zu befolgen, wenn Sie mit Tieren und mit dem AAV-Virus umgehen.
