Dieses Protokoll zeigt ein neuartiges Verfahren zur sequenziellen Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen aus Zebrafisch-Stickys im frühstadium, das präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist seine Flexibilität. Es kombiniert Immunfluoreszenz und Immunhistochemie-Techniken mit einer einzigen Kryosektion, um Die Gewebemorphologie, Kolokalisierung der Expression und Antikörperkompatibilität zu maximieren.
Dieses Protokoll könnte auf andere Fisch- oder Amphibienmodelle angewendet werden, da diese Forscher oft mit ähnlichen Komplikationen bei der Verfügbarkeit von Antikörpern konfrontiert sind und oft ähnliche Arten von Experimenten durchführen. Die Arbeit mit embryonalen Kryosektionen im Frühstadium kann schwierig sein, da sie klein sind und Kryosektionen eine Herausforderung sein können, aber fortgeschrittene Vorbereitung und Praxis werden helfen, alle Kämpfe in dieser Methode zu lindern. Es gibt mehrere Schritte in unserem Protokoll, die eine besondere Handhabung und Sorgfalt erfordern und schwierig zu meistern sein können, ohne dass jemand die Techniken demonstriert.
Um zu beginnen, übertragen sie frühere feste und vorbereitete vierzig Stunden nach der Befruchtung chimäre Zebrafisch-Embryonen aus einem Rohr mit 15 25 OCT-Mischung auf eine Kunststoffform mit Zangen, die jede Übertragung der Mischung minimieren. Füllen Sie die Form etwa die Hälfte mit OCT Medium und mischen Sie die Embryonen darin sanft. Bereiten Sie beschriftete Kunststoffformen vor und übertragen Sie gewünschte Embryonen in die leeren markierten Kunststoffformen, wodurch die Übertragung von OCT-Medium minimiert wird.
Dann vorsichtig mit OCT Medium bis oben in die Formen mit Embryonen füllen. Arbeiten Sie unter einem Licht-Stereomikroskop zur Visualisierung, verwenden Sie Nadeln, um Embryonen in der gewünschten Ausrichtung zu arrangieren. Dann legen Sie die vorbereiteten Formen in einen isolierten Behälter mit einer Metallplattform und frieren Sie sie auf Trockeneis ein.
Legen Sie einen Eiskübel sanft über die Metallplattform, um eine Kühlkammer zu schaffen und frieren Sie für ca. 30 Minuten. Schneiden Sie die eingebetteten Embryonen mit einem Kryostat, das auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist, in 10 bis 12 Mikrometer dicke Kryosektionen, während Sie die Tiefe des Abschnitts periodisch auf einem Mikroskop überprüfen, um Ort und Gewebe zu überwachen. Legen Sie die Abschnitte auf geladene Glasrutschen und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Dias dreimal für fünf Minuten in 1X PBS in einem geeigneten Behälter. Legen Sie die Dias auf eine flache Oberfläche in einer feuchten Kammer. Verwenden Sie einen Barrierestift, um die Abschnitte zu skizzieren, um Flüssigkeit auf den Folien zu halten.
Pipette 200 Mikroliter Blockpuffer pro Abschnitt und inkubieren im Blockpuffer für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die primäre Antikörperverdünnung und Blockpuffer vor und mischen Sie sie gut durch Pipettieren. Kippen Sie die Dias vorsichtig, um den Blockpuffer abzutropfen und in die feuchte Kammer zurückzukehren.
Pipetten 200 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Abschnitt auf die Dias und 200 Mikroliter Blockpuffer auf die entsprechenden Abschnitte als Steuerung. Inkubieren Sie die Rutschen bei vier Grad Celsius über Nacht in einer feuchten Kammer mit entionisiertem Wasser gefüllt, um sicherzustellen, dass die Ränder der Kammer zu versiegeln, um Feuchtigkeit zu halten. Waschen Sie die Dias dreimal für fünf Minuten in 1X PBS und in einem entsprechenden Behälter.
Bereiten Sie die sekundäre Antikörperverdünnung während des Waschens und Blockpuffer s und mischen Sie gut durch Pipettieren. Nach dem Verlegen der Dias auf einer ebenen Oberfläche in einer feuchten Kammer, fügen Sie 200 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung pro Abschnitt hinzu. Inkubieren Sie die Dias in sekundärer Antikörperlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten.
Waschen Sie die Dias dreimal für fünf Minuten in 1X PBS in einem geeigneten Behälter. Nachdem Sie die Dias auf eine flache Oberfläche gelegt haben, fügen Sie die kerntechnische Färbelösung auf jeden Abschnitt und inkubieren bedeckt für 10 Minuten. Nach dem Abtropfen der Kernfärbelösung montieren Sie die Dias mit nicht härtenden fluoreszierenden Montagemedien und einem Glasdeckel.
Achten Sie darauf, sie bis zur Bildgebung bei vier Grad Celsius im Dunkeln zu halten. Legen Sie die Rutschen in einzelne Behälter mit 1X PBS und lagern Sie flach bei vier Grad Celsius über Nacht, während sanft rührend, um die Abdeckung sausen genug zu lösen, so dass sie aus, wenn aufgeregt. Achten Sie darauf, nicht auf den Deckelzettel drücken oder versuchen, den Abdeckungsschlupf manuell zu entfernen, aber warten Sie, bis sie mit minimaler Zwangsbewegung kommen.
Nachdem die Deckelschlüpfer entfernt wurden, tragen Sie die Dias vorsichtig in einen Behälter mit frischen 1X PBS. Entfernen Sie die 1X PBS und inkubieren Sie die Dias in 1X tris-gepufferter Salinmitin mit 0,1% eines nichtionischen Tensids dreimal für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Dias in 3%Wasserstoffperoxidlösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
Legen Sie dann die Folie flach und fügen Sie Blockpufferdrop weise an die Oberfläche. Tippen Sie vorsichtig auf die Dias, um den Blockpuffer abzutropfen. Trocknen Sie den Bereich um die Abschnitte und legen Sie die Rutschen flach in eine feuchte Kammer.
Fügen Sie 200 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Abschnitt auf die Dias und in feuchter Kammer bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren. Kippen Sie die Dias vorsichtig, um die primäre Antikörperlösung abzutropfen und in 1X TBST zwei Mal für fünf Minuten zu waschen. Dann bereiten bereit, Hintergrund reduzieren blockierende Reagenz Tropfen klug auf jeden Abschnitt zu verwenden, und in feuchter Kammer bei Raumtemperatur für 20 Minuten brüten.
Tippen Sie vorsichtig auf die Dias, um den Blockpuffer abzutropfen. Trocknen Sie den Bereich um die Abschnitte sorgfältig und legen Sie die Rutschen flach in eine feuchte Kammer. Tragen Sie eine gebrauchsfertige Sekundärantikörperlösung auf jeden Abschnitttropfen auf und brüten Sie 30 Minuten lang in feuchter Kammer bei Raumtemperatur.
Kippen Sie die Dias vorsichtig, um die sekundäre Antikörperlösung abzutropfen und in 1X TBST zwei Mal für fünf Minuten zu waschen. Nach dem Trocknen des Bereichs um die Abschnitte, legen Sie die Dias auf eine flache Oberfläche und fügen Sie 200 Mikroliter des HRP chromogenen Substrats zu jedem Abschnitt hinzu. Starten Sie einen Timer, wenn das Substrat auf die erste Folie aufgebracht wurde, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für drei Minuten.
Abtropfen der Substratlösung. Spülen Sie die Dias kurz in einem geeigneten Behälter mit 1X PBS und waschen Sie sie zweimal für fünf Minuten mit sanfter Rührung in entionisiertem Wasser. Gegenstain die Dias durch Stellen sie in Hämatoxylin-Färbung Lösung für bis zu 30 Sekunden und waschen dreimal für fünf Minuten jeweils in entionisiertem Wasser.
Inkubieren Sie die Rutschen in einem Behälter mit Scotts Leitungswasser für eine Minute und waschen Sie dann dreimal für fünf Minuten wieder in entionisiertem Wasser. Dehydrieren Sie die Dias durch eine Reihe von Ethanolsorten, die in entionisiertem Wasser und Xylol in einer chemischen Haube verdünnt werden. Nach dem Entfernen der Dias von Xylol sofort Toluluin-basiertes Montagemedium hinzufügen und einen Deckelschlupf platzieren.
Um den Erfolg beim Verrutschen der Abdeckung zu gewährleisten, ist es wichtig, von einer Seite der Rutsche zur anderen zu arbeiten und gleichzeitig den Deckelschlupf langsam zu senken, um Blasen zu vermeiden, die das Gewebe verdecken würden. Schließlich können Sie die Dias mit einem zusammengesetzten Lichtmikroskop und einer Digitalkamera bei 100-facher Vergrößerung visualisieren und abbilden. Spezifische Antikörper, die hier verwendet werden, um gleichzeitig proliferierende Zellen und Spenderzellen zu detektieren, identifizierte und quantifizierte Spenderzellen, die sich aktiv ausbreiten.
Nach Immunfluoreszenz und Immunhistochemie ist es wichtig, qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen, um einzelne Zellen genau zu identifizieren. Ein Bildanalyseprogramm wurde verwendet, um Bildüberlagerungen durchzuführen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es am wichtigsten, Fleckendias während der Immunhistochemie angemessen zu färben und entgegenzuwirken.
Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden als Änderungen am ursprünglichen Protokoll durchgeführt werden, z. B. die Verwendung verschiedener Antikörperkombinationen, Gewebetypen oder Arten. Bilder können auch auf verschiedene Weise analysiert werden, um relevante Daten zu erhalten. Diese Technik ermöglichte es uns, die Kolokalisierung und mehrere genetische Hintergründe als eine Möglichkeit zu betrachten, Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen, und könnte ähnlich wie andere Techniken angewendet werden, die eine detaillierte Co-Lokalisierungsanalyse erfordern.
Viele reagenzien in der Immunhistochemie sind gefährlich und sollten entsprechend behandelt werden. Die Arbeit mit Ethanol, Xylol und Befestigungssteifsollte in der Haube durchgeführt werden. DAB-Abfälle sollten als Sondermüll entsorgt und nach DAB-Washes gebleicht werden.
