Der Standardweg, eine Stammzelle aus Zellstoff zu erhalten, ist schlecht effizient, und dies hängt von mehreren Variablen ab. Unser Protokoll ermöglichte es, eine erfolgreiche Isolierung von Stammzellen von behandelten Zähnen in 90% der Fälle zu erhalten. Eine hohe Anzahl von Zellen in wenigen Wochen zu erhalten, ist der Hauptvorteil.
Das ermöglicht es uns, die Zelle in der regenerativen Medizin zu nutzen und eine Biobank zu schaffen, die anderen Wissenschaftlern dieses nützliche Werkzeug zur Verfügung stellt. Das Verfahren zum Öffnen des Zahnes wird von Dr.Constantino Santacroce durchgeführt. Anschließend wird das Protokoll von Stefano Martellucci, dem Doktoranden aus meinem Labor, der der erste Autor des Artikels ist, gezeigt.
Zu Beginn den dritten Molaren vom Patienten extrahieren, schnell mit PBS abspülen, mit dem Medium in ein 15-Milliliter-Reagenzglas geben und in weniger als zwei Stunden ins Labor überführen. Unter einer Biohazard-Haube, verwenden Sie einen Fräser, um den Zahn durch einen koronaren Schneidpass zu öffnen, parallel und tangent, durch das Dach der Zellstoffkammer. Mit einem kleinen Bagger das Fruchtfleisch vorsichtig entfernen und in ein Reagenzglas legen.
Dann mit PBS dreimal waschen, und Zentrifuge bei 2, 500 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand. Setzen Sie das Pellet in Hanks Lösung wieder auf und übertragen Sie die Probe in eine Petrischale.
Entfernen Sie die Hank-Lösung durch Zentrifugation bei 2, 500 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann, mit einem Einweg-Skalpell, teilen Sie das Fruchtfleisch in etwa ein Millimeter Scheiben, und fügen Sie einen Milliliter Typ IV Kollagenase. Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 2, 500 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet im Medium wieder auf. Kultur es in einem T25-Kolben spezifisch für Stammzellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Während der Inkubationszeit, ändern Sie das Kulturmedium alle drei Tage.
Sobald die anhaftenden Zellen den Zusammenfluss erreichen, fügen Sie den Zellen einen Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um sie zu lösen, und brüten die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie vier Milliliter des Kulturmediums im Verhältnis eins zu fünf hinzu, um die Trypsin-Aktion zu stoppen, und zentrifugieren Sie die Zellsuspension sechs Minuten lang bei 259 mal g. Entfernen Sie den Überstand.
Legen Sie dann die Zellen in einen T25-Kolben, um sich zu vermehren. Lösen Sie dann die Zellen drei Minuten lang mit einem Milliliter Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 259 mal g für sechs Minuten.
Entfernen Sie den Überstand, und führen Sie fort, die Zellen auf zytofluorimetrische Analysen zu testen. Um den transienten Prionprotein-Silencing-Schritt durchzuführen, kultiumieren Sie zunächst die menschlichen Zellstoffstammzellen in Sechs-Well-Platten mit zwei Millilitern des Kulturmediums für 24 Stunden. Dann fügen Sie 400 Mikroliter des kleinen störenden RNA PrP Mediums zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden.
Ohne siRNA PrP medium zu entsorgen, 1,6 Milliliter des Kulturmediums im Verhältnis von eins zu fünf hinzufügen und die Zellen 72 Stunden bei 37 Grad Celsius belassen. Nach der Inkubationszeit den Überstand entfernen und die Zellen bei Raumtemperatur dreimal mit zwei Millilitern PBS waschen. Dann fügen Sie zwei Milliliter des neuronalen Kulturmediums hinzu und halten Sie die Zellen sieben bis 14 Tage in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Nach der Inkubationszeit, waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PBS dreimal bei Raumtemperatur, und gehen Sie zur Western Blot Analyse, um auf neuronale Oberflächenantigene zu testen. Um den neuronalen Induktionsprozess durchzuführen, Kultur 2 Millionen menschliche Zahnstoff Stammzellen in sechs-Well-Platten, bis zu 28 Tage von der Zellstoff-Trennung. Alle drei Tage, entsorgen Sie den Überstand.
Waschen Sie dreimal mit zwei Milliliter PBS bei Raumtemperatur, und ersetzen Sie zwei Milliliter des neuronalen Kulturmediums. Nach sieben bis 14 Tagen die Zellen drei Minuten lang mit einem Milliliter Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius ablösen. Fügen Sie dann vier Milliliter des Kulturmediums im Verhältnis eins zu fünf hinzu, um die Trypsin-Aktion zu stoppen.
Um die menschlichen Zellstoffstammzellen durch Durchflusszytometrie zu charakterisieren, Kultur 2 Millionen pro Milliliter der Zellen in Sechs-Well-Platten mit zwei Milliliter des Kulturmediums. Nach 28 Tagen nach der zellärztlichen Trennung oder nach weiteren 14 Tagen mit neuronatorischem Kulturmedium einen Milliliter Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten hinzufügen, um die Zellen zu lösen. Als nächstes fügen Sie vier Milliliter des Kulturmediums im Verhältnis eins zu fünf hinzu, um die Trypsin-Aktion zu stoppen, und zentrilegieren Sie bei 259 mal g bei Raumtemperatur sechs Minuten.
Fixieren Sie die unbehandelten oder behandelten Zellen mit 300 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd in PBS bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes Zentrifugen, entsorgen Sie den Überstand und permeabilisieren Sie die Zellen mit 1% nicht-ionischem Tensid in PBS bei Raumtemperatur für weitere 10 Minuten. Dann zentrifugieren Sie wieder, entsorgen Sie den Überstand und führen Sie die Blockierung mit 5% fettfreier trockener Milch in einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur für eine Stunde durch.
Waschen Sie dreimal mit einem Milliliter PBS, und inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD105, Anti-CD44, Anti-STRO-1, Anti-CD90, Anti-CD73, Anti-Beta-Drei-Tubulin, Anti-NFH und Anti-GAP43 monoklonale Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde. Anschließend zentrieren Sie die Zellen wieder dreimal hintereinander mit einem Milliliter PBS im Sechs-Minuten-Takt und inkubieren Sie dann mit Anti-Maus-PE oder Anti-Kaninchen-CY5-Monoklon-Antikörpern bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde. Verwenden Sie die sekundären Antikörper, um die immunpositiven Zellen zu veranieren, und analysieren Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer.
Kultur 2 Millionen Zellen pro Milliliter der menschlichen Zellstoffstammzellen in Sechs-Brunnen-Platten mit zwei Millilitern des Kulturmediums. Nach 21 und 28 Tagen nach der Zellstofftrennung oder nach weiteren sieben bis 14 Tagen mit dem neuronalen Kulturmedium einen Milliliter trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten hinzufügen, um die Zellen zu lösen. Dann Zentrifuge, entsorgen Sie den Überstand, und fixieren Sie dann die Proben mit 4%Paraformaldehyd in PBS bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Als nächstes Zentrifugen, entsorgen Sie den Überstand, und dann permeabilisieren mit 1%nicht-ionischen Tensid in PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und färben Sie die Zellen mit Kaninchen Anti-PrP monoklonalen Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schließlich Zentrifugen, entsorgen Sie den Überstand, und dann mit Anti-Kaninchen CY5 monoklonalen Antikörper bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde inkubieren.
Analysieren Sie alle Proben mit einem Durchflusszytometer. Nach der Zellstofftrennung wurden Cluster menschlicher Zellstoffstammzellen an der Peripherie erweitert. Ein Vergleich zwischen dem Wachstum dieser Zellen vor und nach der durch EGF/bFGF induzierten neuronalen Differenzierung zeigte signifikante Veränderungen in der Zellmorphologie und dem Auswuchs von Neuriten.
Unbehandelte menschliche Zellstoffstammzellen exprimiert multipotente mesenchymale stromale spezifische Oberflächenantigene wie CD44, CD90, CD105, CD73 und STRO-1. Nach geeigneten neuronalen Induktionsreizen exprimierten diese Zellen spezifische neuronale Marker, wie Beta-Drei-Tubulin, NFH und GAP43. Unbehandelte oder behandelte Zellen drückten keine hämatopoetischen Marker wie CD14 und CD19 aus.
Nach 28 Tagen wurde Prionprotein im Vergleich zur entsprechenden Negativkontrolle in menschlichen Zellstoffstammzellen präkoziert und seine Expression nach dem durch EGF/bFGF induzierten neuronalen Differenzierungsprozess erhöht. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass das Silencing des Prionproteins durch sRNA vor EGF/bFGF-Stimuli den neuronalen Differenzierungsprozess menschlicher Zellstoffstammzellen beeinflussen könnte, indem die Expression neuronaler Marker Beta-Drei-Tubulin und NHF verhindert wird. Das Wichtigste ist die Wahl des Enzyms, um die Zellen vom Zellstoff zu trennen.
In der Tat, wenn das Enzym zu aggressiv ist, könnten die Zellen beschädigt werden und ihr Wachstum und differenzierungsfähig sein. Die Zellstoffstammzellen sind ein hervorragendes Experimentelles Modell, das in vivo- und in-vitro-Studien im Bereich der regenerativen Medizin eingesetzt werden kann. Da PrP eine Schlüsselrolle im neuronalen Differenzierungsprozess von Zellstoffstammzellen spielt, kann dieser Marker ein ausgezeichneter Kandidat als wirksames Ziel bei neurodegenerativen Erkrankungen sein.
Der wichtigste Aspekt zu beraten ist der Gesundheitszustand der Patienten, wie das Fehlen von Infektionskrankheiten.
