Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen auf dem Gebiet der Gentherapie, Onkolyse und GenetischeN Impfung zu beantworten. Es erleichtert das Verständnis und die Modulation von Vektorhosts Interaktionen von Adenovirus-Gentransfervektoren, dem am häufigsten verwendeten Vektortyp in klinischen Studien bis heute. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Adenovirus-Capsulate mit einfacher Chemie gezielt in hochdefinierter Weise an ausgewählten Positionen und in variablem Umfang modifiziert werden können.
Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie aus, da die Vektorhostmodifikation nicht nur analysiert, sondern auch patientenorientiert moduliert werden kann. Obwohl diese Methode Einblicke in bestimmte Vektor-Wirt-Wechselwirkungen bietet, kann sie auch für die Kennzeichnung und Verfolgung von Viruspartikeln in lebenden Organismen wie Mäusen verwendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, mit der einzigartigen Kombination von Virologie und organischer Chemie zu kämpfen, die praktisches Wissen aus beiden Bereichen erfordert.
Eine besondere Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da hier Methoden aus der Organischen Chemie auf Methoden aus der Zellbiologie und Virologie treffen, einschließlich feldspezifischer Handhabungstricks. Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens alle Puffer wie im Textprotokoll beschrieben vor. Wiegen Sie einen Milliliter jedes Gradientenpuffers, um seine Dichte zu überprüfen.
Nach der Sterilisation aller Puffer die Puffer, die TCEP enthalten, für etwa 30 Sekunden mit Argongas streuen, um eine Oxidation des TCEP zu verhindern. Bewahren Sie die Durchstechflaschen mit der massiven pulverförmigen Kupplung in größeren Schläuchen auf, die jeweils mit einem Kissen aus Kieselgelperlen gefüllt sind, um den Aufbau von Kondenswasser beim Auftauen der Durchstechflaschen zu verhindern. Legen Sie diese Rohre in einen Trockentrockner.
Entfernen Sie die Luft im Trockenbau und ersetzen Sie sie durch Argongas. Dann jedes Rohr fest schließen und in einen größeren Behälter mit Kieselgelperlen geben. Sobald alle Rohre verlegt sind, schließen Sie den Behälter.
Bewahren Sie den Behälter bei 80 Grad Celsius auf, bis er einsatzbereit ist. Wenn Sie bereit zum Tauen sind, legen Sie den Behälter in eine Schicht Kieselsäureperlen in einem Trockenschrank. Lassen Sie den Behälter langsam auf Raumtemperatur erwärmen und öffnen Sie dann den Behälter.
Wenn Zellen den optimalen zytopathischen Affekt erreichen, sammeln Sie sie, indem Sie die Platten kratzen und den Überstand auf Zentrifugenrohre übertragen. Drehen Sie die Zellsuspension bei 400 mal G für 10 Minuten. Als nächstes setzen Sie das Zellpellet in vier Milliliter Ad-Puffer mit 10 Millimolar TCEP wieder auf und übertragen Sie die resultierende Lösung in ein steriles 50-Milliliter-Rohr.
Die Lösung in flüssigem Stickstoff einfrieren und dann in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen. Wiederholen Sie diesen Gefriertauzyklus dreimal, um den Vektor zu retten. Zentrifuge bei 5000 G und vier Grad Celsius für zehn Minuten.
Während zentrifugieren zwei Ultrazentrifugenrohre, um die Vorbereitung zwei gleiche Cäsiumchlorid Schritt Gradienten beginnen. Fügen Sie drei Milliliter der unteren Phase zu jedem dieser Rohre hinzu. Markieren Sie den Pegel der unteren Phase auf dem Rohr, bevor Sie die obere Phase laden.
Dann stapeln Sie vorsichtig fünf Milliliter der oberen Phase bis zur unteren Phase und pfeifen Sie sie sehr langsam entlang der Wände des Rohres. Wenn die Steigungen vorbereitet sind und die Zentrifugation vollständig ist, lädt der Überstand aus der Probe gleichmäßig über die beiden Gradienten. Füllen Sie den verbleibenden Platz in jedem Gradientenrohr mit einem Ad-Puffer, der zehn Millimolar TCEP enthält und stellt sicher, dass die Rohre bis ganz nach oben gefüllt werden.
Passen Sie das Gewicht der gegenüberliegenden Rohre auf eine Nullgewichtsdifferenz an. Und zentrifugieren Sie die Zentrifuge für 176000 mal G und 4 Grad Celsius für zwei Stunden. Danach verwenden Sie eine Klemme, um ein Ultrazentrifugationsrohr an einem Ständer zu befestigen.
Achten Sie darauf, den Bereich um die untere Phase Ebene markiert zugänglich zu lassen. Legen Sie die Gänsehalslampe über das Rohr. Um die Markierung herum, an der Grenze zwischen der unteren und oberen Phase, sollte ein deutliches Band sichtbar sein.
Punktieren Sie das Rohr mit einer Nadel, und aspirieren Sie das Vektorband in eine Spritze, um den Vektor zu sammeln. Übertragen Sie gesammelte Vektorvirons auf ein 15-Milliliter-Rohr und berechnen Sie die Menge des Kopplungssubstrats, die im Textprotokoll beschrieben wird. Übertragen Sie dann die Vektorlösung in ein Rohr von entsprechender Größe.
Und die berechnete Menge der Kupplung Verbindungen Lagerlösung. Durch Overhead-Rotation bei Raumtemperatur eine Stunde lang sanft mischen. Passen Sie als Nächstes das Gesamtvolumen der Vektorlösung auf sechs Milliliter an, indem Sie den Ad-Puffer hinzufügen.
Reinigen Sie den Vektor aus dem unreagierten Kopplungsmoiety mit einem zweiten Cäsiumchloridbindungsschritt, wie im Textprotokoll beschrieben. Punktieren Sie das Rohr mit einer Nadel und aspirieren Sie das Vektorband in eine Spritze. Übertragen Sie die gesammelten Vektoren in eine 15-Milliliter-Röhre.
Wenn die Kombination aus beiden Gradientenröhren weniger als 2,5 Milliliter beträgt, stellen Sie die Lautstärke auf 2,5 Milliliter ein, indem Sie den Ad-Puffer hinzufügen. Laden Sie die kombinierten Virons in eine gleich verbesserte Pd-Spalte und verwerfen Sie den Durchfluss. Fügen Sie dann drei Milliliter Ad-Puffer zur Spalte hinzu und sammeln Sie den Durchfluss durch.
Fügen Sie 333 Mikroliter Glycerin in den gesammelten Durchfluss ein, um die Endkonzentration von zehn Prozent zu erhalten. Teilen Sie diese in geeignete Aliquots auf. Achten Sie darauf, ein Aliquot von 20 Mikrolitern für eine strengere Bestimmung durch OD 260 Messung enthalten.
Bewahren Sie die Vektorlösung bei 80 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Repräsentative Ergebnisse der Auswirkungen auf 293 Zellen deuten darauf hin, dass die Vektorproduktion erfolgreich ist. Zellen sollten Morphologie 40-48 Stunden nach der Inkulturulation mit dem Virusvektor zeigen.
Silbergebeizt SDS-Phagen wird dann verwendet, um die Kopplungseffizienz zu bewerten. Vektoren mit Cysteins, die sowohl mit dem hexonmodifizierten als auch mit dem unveränderten Hexon in die Capsomere-Pentonbasis eingeführt werden, werden ausgeführt. Die Hexon-Bänder weisen eine Verschiebung auf, die auf eine erfolgreiche Modifikation von über 90 Prozent der Monomere pro Capsid hinweist.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, eine reduzierende Umgebung für nicht modifizierte Vektorpartikel zu gewährleisten. Nach dem Umbau ist eine regelmäßige Atmosphäre geeignet. Präzise dokumentarische Berechnungen müssen eine quantitative Modifikation aller Vektorteilchen gewährleisten.
Die Entwicklung dieser Technik hilft der Forschung auf dem Gebiet der Gentherapie, sichere und mangelhafte Strategien für die Vektorabgabe weiter zu erforschen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Kopplung von Liganden zum Targeting oder Fluoreszenzfarbstoffe zur Kennzeichnung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Rezeptornutzung und Bioverteilung zu beantworten. Bitte achten Sie darauf, Ihre lokalen GVO- und Arbeitssicherheitsvorschriften zu befolgen.
