Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Infektionskrankheiten zu beantworten. In Bezug auf Dengue-Fieber, oder Chikungunya-Fieber. Der Hauptvorteil dieser Technik selbst, ist es in der Lage, virale RNA auf einfache und schnelle Weise zu quantifizieren.
Obwohl diese Methode Einblick in eine grundlegende Virusforschung geben kann, kann sie auch auf andere Forschungen angewendet werden, wie z. B. durch Put-Medikamenten-Screening-Studie und klinische Diagnose gegen humane bevölkerungsbeschmutzende Viren. Eine wichtige Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Da die Probenverarbeitungsstempel und ein Biosicherheitsschrank wichtig sind, um Kreuzkontaminationen oder Laborinfektionen zu vermeiden.
Demonstriert wird das Verfahren von einem Assistenzprofessor und unserem technischen Assistenten aus unserem Labor. Nach der Vorbereitung der DNA-Vorlage für den RNA-Standard die In-vivo-Transkriptionsreaktion mit 100 Nanogramm der vorbereiteten DNA-Vorlage in einer 0,2 Milliliter-PCR-Röhre mischen. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler für zwei Stunden.
Danach einen Mikroliter DNAase hinzufügen und die Inkubation bei 37 Grad Celsius 15 Minuten fortsetzen. Legen Sie ein RNA-Reinigungskit fest und fügen Sie 80 Mikroliter RNAase-freies Wasser und 350 Mikroliter Aufnahmepuffer, einschließlich 1%Betamarcaptoethanol, in eine 1,5-Milliliter-Röhre ein. Fügen Sie 250 Mikroliter 100% Ethanol hinzu und verwenden Sie eine Pipette zum Mischen.
Dann montieren Sie eine RNA-Reinigungssäule mit einem Sammelrohr. Übertragen Sie die RNA-Probe in die Reinigungskolonne. Zentrifugieren Sie die Säule 15 Sekunden lang bei 8.000 mal G und entsorgen Sie den Durchfluss.
Als nächstes 500 Mikroliter Waschpuffer auf die Säule und Zentrifuge bei 8 000 mal G für zwei Minuten auftragen. Danach die Säule in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr geben. 50 Mikroliter RNAase freies Wasser hinzufügen und bei Raumtemperatur für eine Minute brüten.
Zentrifugieren Sie die Säule mit maximaler Geschwindigkeit für eine Minute, um die RNA zu entwirn. Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte von 3 Mikrolitern der gesamten RNA bei 260 Nanometern. Bestimmen Sie dann die Kopiernummer des synthetisierten Dengue-Virus drei erstklassige UTR-RNA.
Bewahren Sie den RNA-Standard bei minus 80 Grad Celsius auf, bis er einsatzbereit ist. Mischen Sie zunächst 199 Mikroliter Verarbeitungspuffer mit einem Mikroliter Nuklease-freier Proteinase K. Mit Zellkulturmedium das vorbereitete Dengue-Virus drei Prime-UTR-RNA eins bis zehn seriell verdünnen, um RNA-Standards in Konzentrationen von 5 000 000 bis 5 000 Kopien pro Mikroliter zu erhalten, indem pipettierenundd und wirbeln. Übertragen Sie 5 Mikroliter des Kulturüberstandes von Dengue-Virus infizierten Zellen und das Dengue-Virus 3 Prime UTR RNA Standard entweder auf A2 PCR-Streifen oder die Brunnen einer 96 Well PCR Platte.
Fünf Mikroliter der Lösung mit Verarbeitungspuffer und Proteinase K.Zentrifuge kurz bei 200-fachg für fünf Sekunden mischen. Inkubieren Sie die Proben in einem Thermocycler bei 25 Grad Celsius für zehn Minuten und dann bei 75 Grad Celsius für fünf Minuten. Mit Dengue-Virus drei Prime UTR spezifische Primer und eine fluorogene Sonde, bereiten Sie eine RTQ PCR Master-Mix mit einem einstufigen RT PCR Reagenz in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.
Alloquote acht Mikroliter des Master-Mix in einen Brunnen einer 96-Gut-Echtzeit-PCR-Platte. Dann fügen Sie zwei Mikroliter jeder Probe zu jedem Brunnen der 96 gut Echtzeit-PCR-Platte hinzu. Versiegeln Sie die Platte mit optisch klarem Klebefilm.
Zentrifugieren Sie die Platten kurz bei 200 mal G für fünf Sekunden, um Luftblasen zu entfernen. Platzieren Sie dann die Platte in einem Echtzeit-PCR-Instrument. Navigieren Sie mit einer IN Echtzeit-PCR-Software zum Eingerichtetfenster und weisen Sie den Brunnen einer Reaktion zu, die als unbekanntes Beispiel analysiert werden soll.
Als nächstes weisen Sie den Brunnen des seriell verdünnten Dengue-Virus drei prime UTR RNA als Standard zu und geben Sie die erwartete Kopierzahl des RNA-Standards in jedem Brunnen ein. Weisen Sie das Nicht-Vorlagen-Steuerelement als Negativsteuerelement zu. Starten Sie dann das RT PCR-Instrument und fahren Sie die Platte wie im Textprotokoll beschrieben.
Klicken Sie im Analysefenster auf Analysieren, und stellen Sie sicher, dass der Korrelationskoeffizient der generierten Standardkurve 0,98 entspricht oder größer ist. Verwenden Sie im Allgemeinen die Standard-CT-Einstellungen für die Analyse. In dieser Studie wird eine serielle zehnfache Verdünnung der Standard-Dengue-Virus-RNA einer direkten RTQ-PCR-Analyse mit drei erstklassigen UTR-spezifischen Primern und einer fluorgenen Sonde unterzogen.
Die lineare Kurve dieser Analyse zeigt, dass die Korrelation gut ist. Als nächstes wird dieser direkte RTQ PCR-Test angewendet, um das Dengue-Virus im Kulturüberstand von virusinfizierten Zellen zu quantifizieren. Eine gute Korrelation zwischen dem Dengue-Virus-Infektionstiter und dem CT, einer Zykluszahl, die als der Punkt betrachtet wird, an dem das fluoreszierende Signal mit exponentiellem Wachstum über dem Hintergrund steigt.
Wenn CT-Werte, die aus einer seriellen Verdünnung des Dengue-Virusbestands mit bekannten infektiösen Titfern erzeugt werden, auf der zuvor generierten Standardkurve dargestellt werden, liegen die Daten für die Proben zwischen 08 und 8 000 PFU pro Reaktion im Bereich der Proben, die der Standard-RNA ausgesetzt sind. Dies deutet darauf hin, dass Dengue-Virus-Proben mit einer breiten Palette von infektiösen Titern gleichzeitig analysiert werden können, wenn diese Technik verwendet wird. Dieser Test wird weiter auf seine Anwendbarkeit auf die Validierung antiviraler Wirkstoffe gegen das Dengue-Virus geprüft.
Bei Behandlung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter MPA wird eine Reduktion der von DMSO behandelten Kontrollkultur um ca. 99,87 % beobachtet. Schließlich werden Anwendungen dieses Assays mit anderen RNA-Viren getestet. Wenn ein Bestand an Yellow Fever Virus 17D-Impfstoffstämmen direkter RTQ PCR ausgesetzt ist, wird eine Standardkurve mit einer guten direkten Korrelation zwischen Virustitres und CT-Werten erzeugt.
Ebenso ergibt die direkte RTQ PCR-Analyse des Masernvirus und des Rohstammbestands des Chikungunya-Virus eine gute Regression zwischen infektiösen Titern und CT-Werten. Diese Technik wird den Forschern auf dem Gebiet der Screening-Studie den Weg ebnen. Eine große Anzahl von Proben zur Erforschung neuer antiviraler Medikamente zu ermöglichen, ist gleichbedeutend mit vereinfachend.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit reiniösen Materialien extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und einem sauberen Biosicherheitsschrank sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
