Diese Methode kann helfen, einige der wichtigen Fragen im Bereich der Bio-Prozessherstellung in Bezug auf Aspekte der Zellliniencharakterisierung und Mediate- und Prozessoptimierung zu beantworten. Vorteile dieser Technik sind, dass sie eine bessere Kontrolle in Schüttelkolben bietet und die Automatisierung und die Leistung einer großen Anzahl kleiner Studien für eine schnelle Datengenerierung ermöglicht. Die Demonstration des Verfahrens wird sein, Sai Rashmika Velugula und Casey Kohnhorst, Forschungsstipendiaten in meinem Labor.
Beginnen Sie damit, einen Bestand von dreimal 10 bis zum siebten Show-Zellen pro Milliliter Gefriermedium in einem 37 Grad Celsius Wasserbad einzutauchen. Wenn nur noch ein kleiner Eissplitter übrig bleibt, die schnell aufgetaute Zellsuspension ein paar Mal sanft pfeifen und einen Milliliter Zellen in einen sterilen 125 Milliliter entlüfteten Schüttelkolben mit 29 Milliliter OptiCHO-Medium übertragen. Legen Sie den Kolben in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 8% CO2 mit schütteln 130 U/min.
Subkulieren der Zellen nach 72 Stunden in 100 Milliliter frisches 37 Grad Celsius Medium in einem 125 Milliliter Spinnerkolben für eine weitere 72-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius und 8% CO2 unter Rühren bei 70 U/min. Am dritten Tag der Subkultur, fügen Sie frische vorgewärmte Medium auf den Spinnerkolben, um die Zellen bei einer Lebensfähigkeit von mindestens 90% für die letzten 24 Stunden Kultur zu halten. Klicken Sie am nächsten Morgen auf das Remote-Desktop-Symbol und klicken Sie auf Verbinden.
Wenn der Remote-Desktop angeschlossen ist, öffnen Sie die Zellenzählersoftware, und installieren Sie ein neues Reagenzien-Pak. Dann leeren Sie den Trypan Blue Abfall und grunden Sie das System. Als Nächstes minimieren Sie die Remote-Verbindung und öffnen Sie die Mikro-Bioreaktor-Software, indem Sie ein vorhandenes Experiment als Vorlage verwenden, um ein neues Experiment zu erstellen.
Bevor Sie einen Lauf starten, definieren Sie die Platten, die während des Laufs im Mimik-Bereich der Software verwendet werden, und platzieren Sie 12 sterile Kulturgefäße in jeder Kulturstation. Legen Sie autoklavierte Klemmplatten auf die Gefäße und legen Sie die Rührplatten auf die Klemmplatten, um sicherzustellen, dass jeder Stift sicher eingesetzt wird. Dann sichern Sie die Klemmplatten mit den schrauben und mitgelieferten Schrauben und Nobs.
Um das System zu starten, scannen Sie den Barcode, der mit jedem Kulturgefäß geliefert wird. Das System wird initialisieren und überprüfen, ob die entsprechenden Schiffe vorhandensein. Stellen Sie die Temperaturregelung auf 37 Grad Celsius und das Rühren auf 1.000 Umdrehungen um 1.000 Umdrehungen und schalten Sie den ph-Monitor für gelösten Sauerstoff ein.
Führen Sie als Nächstes das mittlere Ladeprogramm aus. Wenn das gesamte Medium geladen ist, werden 35 Mikroliter EX-CELL Antifoam aus der Antischaumplatte zu den Kulturgefäßen hinzugefügt. Nach 30 Minuten beginnen Die Aufzeichnung des gelösten Sauerstoffs und PH innerhalb der Kulturmedien, so dass der gelöste Sauerstoff einen Sollwert von 50% erreichen Kannierstifierung die Hintergrundgrundzusätze einschalten, um einen PH-Sollwert von 7,1 für alle Kulturgefäße zu erreichen.
Führen Sie am nächsten Morgen den angehaltenen PH-Schritt aus und übertragen Sie den gesamten Inhalt des Spinnerkolbens zur Zentrifugation in ein steriles 250 Milliliter Konikonrohr. Setzen Sie das Pellet in einem ausreichend frischen Medium aus, dass die Enddichte ein mal 10 bis die sechste CHO-Zelle pro Milliliter beträgt, nachdem sie das Inokulum zu den Kulturgefäßen hinzugefügt hat, und fügen Sie die suspendierten Zellen in die entsprechenden Brunnen einer sterilen 24-Well-Platte ein. Fügen Sie drei Milliliter Inokulum zu jedem Brunnen hinzu und legen Sie die Inokulumplatte auf den dafür vorgesehenen Schreibtisch in der Haube.
Lassen Sie dann die Kulturgefäße mindestens eine Stunde ausdemieren und initiieren Sie den fünf EX-CELL-Zählschritt im Programm. Zur täglichen Nährstoff- und Metabolitenanalyse am zweiten Tag die Probenröhrchen auf die dafür vorgesehenen Decks legen und offene Mikrozentrifugenrohre in die entsprechenden Halter laden. Legen Sie dann die Proben in das Analysator-Tray, um die Nährstoffanalyse durchzuführen.
Um den Lauf zu beenden, schalten Sie zuerst die Temperaturregelung aus, gefolgt von der Rührung. Stoppen Sie die Ph-Steuerung und die Hintergrundgrundzusätze, alle anderen Steuerelemente und den Systemmonitor. Lösen Sie die Klemme und rühren Sie Platten, entfernen Sie die Kulturgefäße und schrauben Sie die Trocknungsplatten in die Kulturstation.
Führen Sie dann den zweistündigen Trocknungszyklus auf dem Programm aus; klicken Sie auf Stopp in der Bioreaktor-Software, sobald der Trocknungszyklus abgeschlossen ist. Um die Zellen zu ernten, werden die Zellkulturflüssigkeit aus den Reaktorgefäßen in entsprechende konische Rohre zur Zentrifugation geleitet und die Überstände durch sterile 0,22 Mikrometer PVDH-Filter gefiltert. Dann übertragen Sie einen Milliliter jedes sterilen Zellkulturüberstandes in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren für negative 20 Grad Celsius Lagerung bis zur Titeranalyse.
Um die IgG-Titter der Proben zu messen, schalten Sie zunächst das Protein-Hilfs-Biosensorsystem ein. Nachdem die Lampe mindestens eine Stunde lang erwärmt hat, lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur ausdemieren und eine Proteinhilfespitze pro Probe in frischem Zellmedium für mindestens 30 Minuten vortränken. Stellen Sie dann die Plattentemperatur auf 26 Grad Celsius ein.
Laden Sie die Samples in das System, und führen Sie den Test mit dem standardmäßigen Test mit hoher Empfindlichkeit mit Regeneration in der Datenerfassungssoftware aus. Mit dem integrierten Zellzähler können die durchschnittlichen lebensfähigen Zelldichten und Viablen täglich für alle Kulturbedingungen ermittelt werden. Mit dem Nährstoffanalysator können wir auch die Nährstoff- und Nebenproduktprofile erhalten, die die Machbarkeit der Überwachung dieser Eigenschaften im Mikrobioreaktorsystem belegen.
Darüber hinaus kann die Gesamtproduktivität der Zellkulturen unter den verschiedenen Kulturbedingungen von Interesse mit dem Protein-Hilfe-Biosensorsystem quantifiziert werden, wie gezeigt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Protokoll nur funktioniert, wenn die Programmierung korrekt durchgeführt wird; um die rechtzeitige Ausführung von Protokollschritten mit minimalen Fehlern zu gewährleisten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie:Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Mehrwinkel-Lichtstreuung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den physikalischen und chemischen Eigenschaften des hergestellten Produkts zu beantworten.
