Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen bei der Herstellung des Gallium 68 mit RGD-Peptid und der Methode zur biologischen Bewertung seiner Analoga zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um ein einfaches systemisches Protokoll für die Entwicklung eines neuen radiometallbeschrifteten Peptids handelt. Demonstriert wird das Verfahren von Ki-Hye Jung, einem Post-Doc unseres Instituts.
Beginnen Sie mit 0,5 Molsalzsäure, um radioaktiv markiertes Galliumtrichlorid aus einem radioaktiv markierten Gallium-Germaniumgenerator zu eluten. Reinigen Sie die Verbindung in fünf Milliliter Reaktionsfläschchen mit Stickstoffgas bei 80 Grad Celsius. Gefolgt von der Zugabe von 100 Mikrogramm Argininglycinacetat oder RGD-Peptid in einem Molaren-Natriumacetat zur getrockneten Verbindung.
Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch bei 80 Grad Celsius für fünf Minuten, bevor Sie das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Um das Rohprodukt mit einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zu reinigen, fügen Sie die Lösung einer C18-Säule hinzu und übergeben Sie die Lösung durch eine C18-Reverse-Phase-Patrone. Waschen Sie die Patrone mit zwei Millilitern Saline und elute das radioaktiv markierte Peptid mit 0,7 Milliliter 95% Ethanol gefolgt von der Entfernung des Lösungsmittels bei 80 Grad Celsius unter Stickstoffgas für 20 Minuten.
Rekonstituieren Sie das gereinigte Peptid in PBS und filtern Sie das radioaktiv markierte Produkt durch ein steriles 0,22 Mikron steriles Sieb. Formulieren Sie das Peptid in einem Milliliter steriler Kochsalinelösung und erkennen Sie einen Mikroliter Peptidlösung auf eine sofortige Dünnschichtchromatographieplatte. Entwickeln Sie dann die Platte in der Kammer, die wässrige 0,1 molar Zitronensäure enthält, bis neun Zentimeter von der Stelle entfernt, um die radiochemische Ausbeute zu bestimmen.
Um die in vivo zelluläre Aufnahme des Peptids zu beurteilen, behandeln Sie ein mal 10 bis die sechste menschliche Glioblastom-Zellen pro Brunnen in sechs Brunnenplatten mit 111 Kilobecquerel radioaktiv markiertem RGD-Peptid pro Brunnen bei 37 Grad Celsius für 30, 60, 90 oder 120 Minuten in Dreifachen. Am Ende der Inkubation die Brunnen zwei Mal mit zwei Millilitern PBS pro Wäsche waschen und die Zellen mit 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA in PBS bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten ernten. Übertragen Sie dann die Zellen von jedem Brunnen in 15 Milliliter konische Röhren, um die radioaktiv markierte Peptidaufnahme auf einem Gammazähler zu messen.
Um die Serumstabilität des radioaktiv markierten RGD-Peptids zu bewerten, fügen Sie 500 Mikroliter frisch zubereitetes Mausserum, 500 Mikroliter humanes Serum und 500 Mikroliter PBS zu 50 Mikroliter jeder Probe hinzu und inkubieren Die Mischungen bei 37 Grad Celsius für bis zu zwei Stunden. Dann ein bis zwei Mikroliter jeder Probe nach 30, 60, 90 und 120 Minuten Inkubation auf eine instant dünne Schichtchromatographieplatte einlagern und die Platten wie gezeigt entwickeln. Um die Lipophilie des Peptids zu bestimmen, fügen Sie 10 Mikroliter des radioaktiv markierten RGD-Peptids zu einem oktanalen PBS-System hinzu und mischen Sie die Fläschchen großzügig für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Dann sammeln Sie das Peptid durch Zentrifugation und ernten Sie 100 Mikroliter Probe aus jeder Schicht für die Messung mit einem Gammazähler. Um radioaktiv markierte Tumormodelle zu erzeugen, laden Sie fünfmal 10 auf die sechste menschliche Glioblastom-Zelle in 100 Mikroliter PBS in eine halbe Zoll-Insulinspritze, die mit einer 28-Meter-Nadel pro zu injizierender BALB/c-Nacktmaus ausgestattet ist, und liefern die Tumorzellen subkutan in die linke Flanke jedes Empfängers. Zur In-vivo-Quantifizierung des Peptids durch Positronen-Emissionstomographie oder PET, legen Sie den Kopf eine tumortragende, anästhesierte Maus in das PET-Portal und verabreichen intravenös 7,4 Megabecquerel radioaktiv markierter RGD-Peptidlösung in 200 Mikroliter PBS in jedes Xenograft-Mausmodell über die Schwanzvene über eine Minute, während Sie einen PET-Scan im Listenmodus durchführen.
Zur Ex-vivo-Bioverteilungsanalyse 0,37 Megabecquerel radioaktiv markiertes RGD-Peptid in 200 Mikroliter PBS in die Schwanzvene eines xenografierten, tumortragenden Tieres injizieren und die interessierenden Gewebe nach der Injektion in 30, 60, 90 und 120 Minuten ernten. Dann wiegen Sie die Gewebe und messen ihre Radioaktivität mit einem Gammazähler. Nach der Chelatierung können Reaktionsunreinheiten durch hochleistungsreiche Flüssigkeitschromatographie erfolgreich entfernt werden, wie gezeigt.
Eine radiochemische Reinheit des radioaktiv markierten RGD-Peptids kann mit einer spezifischen Aktivität am Ende der Synthese zwischen 90 und 130 Megabecquerel pro Nanometer erreicht werden. Die PET-Analyse zeigt eine anfängliche hohe Aufnahme in den wichtigsten Organen, einschließlich leber, nieren, herz, muskel, sowie innerhalb des Tumors. In den späteren Stadien der Analyse kann die Tumorregion klar visualisiert werden, wobei das Tumor-Muskelverhältnis unverändert bleibt, was auf die kinetische Stabilität des Peptids hinweist.
Die Ex-vivo-Bioverteilungsanalyse zeigt, dass die akkumulierte Radioaktivität im Tumor im Laufe der Zeit abnimmt, wie von den in vivo PET-Befunden erwartet. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass unsere Methodik zwar nicht den empfindlichen biologischen Bewertungsprozess ersetzen kann, aber dazu verwendet werden kann, die Zeit und die Kosten einer traditionellen Arzneimittelentwicklungspraxis erheblich zu nutzen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit den radioaktiven Stoffen extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie die Verwendung der richtigen Schutzausrüstung wie ein persönliches Dosimeter und thermolumineszierendes Dosimeter sollte immer während der Durchführung dieser Verfahren genommen werden.
