Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Canadian Institutes of Health Research (148808 und 148792), SE wurde unterstützt durch ein Herz und Stroke Foundation, Personal Award vom Ontario Provincial Office, March of Dimes, Ted Rogers Centre for Heart Research und Peter Munk Herz Zentrum. XCC hält eine CIHR Banting Fellowship. LA hält ein Herz & Schlaganfall/Richard Lewar Zugehörigkeit Award.

Ethik-Anweisung: Dieses Protokoll wurde überprüft und genehmigt Animal Care auf vom Ausschuss des University Health Network (Toronto, Kanada) und ist in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care.
1. Puffer Vorbereitung
<ol><li>HBB Puffer (Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS), 2 % Hitze inaktiviert Rinderserum, 0,2 % Rinderserumalbumin) vorzubereiten. Fügen Sie 10 mL Hitze Rinderserum und 1 g Rinderserumalbumin, 500 mL HBSS inaktiviert. Filter durch einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie FACS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 2 % Hitze inaktiviert Rinderserum, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA, pH 8,0)). Fügen Sie 10 mL Hitze Rinderserum und 1 mL 0,5 M EDTA bis 500 mL PBS inaktiviert. Filter durch einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Lösungen können bei 4 ° C bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.</li>
</ol>(2) Kennzeichnung des zirkulierenden Leukozyten
<ol><li>Aseptisch bereiten Sie Anti-Maus CD45 Injektion mit 1 µg des Antikörpers in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für eine endgültige Injektionsvolumen von 200 µL/Maus verdünnt. Ladevolumen in eine 28,5 G Insulin Spritze und Licht fernhalten. Hinweis: Verwenden Sie zwei verschiedene Fluorochrom-markierte Anti-CD45 Antikörper um den intravaskulären (gefärbt durch intravenöse Verabreichung) Die intrakardiale Färbung unterscheiden (gebeizt nach der Verdauung, siehe Schritt 4).</li>
	<li>
Wärmen Sie indem man die Rute zu einer roten Wärmelampe für 5 min es Mäuse (8 – 12 Wochen alt vor). Achtung: Überhitzen Sie das Tier nicht. Halten Sie die Lampe in einem sicheren Abstand (> 30 cm).<ol>
<li>Zurückhalten Sie das Tier in der sternalen Position mithilfe eines entsprechenden Geräts. Setzen Sie aus und stabilisieren Sie das Heck mit der nichtdominanten Hand durch Immobilisierung der Schwanzwurzel mit den Zeige- und Mittelfinger und der Mitte distalen Region der Schwanz mit Daumen und Ringfinger. Achtung: Beziehen Sie zuviel Kraft an der Spitze der Rute nicht, wie die Haut abgezogen werden kann. Stechen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in die Vene. Halten Sie die Nadel parallel zu der Vene zu allen Zeiten, da es leicht zu durchstechen die Vene. Hinweis: Blut in die Spritze gelangen können auftreten und ist ein Zeichen für eine gute Injektion. Biegen die Nadel in einem Winkel von 90° kann intravenös zu verabreichenden Verwaltung erleichtern. Bestätigen Sie mit Ihrer Sicherheit Büro wie Biege Nadeln eine Gefahr darstellen können.</li>
		<li>Injizieren Sie 200 µL intravenös in die Rute Vene. Die Flüssigkeit sollte leicht fließen und deaktivieren Sie vorübergehend die Vene. Achtung: Nicht mit Gewalt Flüssigkeit im Widerstand erfüllt ist. Dies ist Zeichen für Abhandenkommen der Nadel.</li>
		<li>Lassen Sie Antikörper für 5 min vor menschlich euthanizing Maus zirkulieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Herz zu isolieren und die Verdauung
<ol><li>
Mäuse mit CO2 einschläfern oder durch andere Verfahren institutionell anerkannte Euthanasie.
	<ol>
<li>Platzieren Sie für CO2 Euthanasie den Mauszeiger in der CO2 -Kammer und die Füllrate auf 20 % des kammervolumens pro Minute (d. h., wenn die Kammer 10 L, Füllung bei 2 L/min). Führen Sie für 2 min und Monitor Maus bis Atmung aufgehört hat.</li>
		<li>Schalten Sie die CO2 und lassen Sie die Maus für eine zusätzliche 1-2 min. sicher atmen aufgehört hat, vor dem Öffnen der Kammers und führen ein Zeh Kneifen um zu bestätigen, dass die Maus tot bevor Sie mit die Maus zu verarbeiten ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol. Heben Sie die Haut am Bauch und sezieren Sie die Maus durch Schnitt entlang der ventralen Mittellinie Anfang auf der Ebene von der Hüfte bis zum Brustbein. Öffnen Sie den Bauch und bewegen Sie die Leber, das Zwerchfell verfügbar zu machen.</li>
	<li>
Schneiden Sie die Membran dann die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie, wobei Sie darauf achten, um zu vermeiden, Punktion, Lunge und Herz.
	<ol>
<li>Expose das Herz durch Peeling damals die Rippen, schneiden zuerst die linken Vorhöfen gefolgt von den rechten Herzvorhof. Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Schneiden die Vorhöfe, sicherzustellen, dass keine Arterien oder Venen verletzt werden, da dies die Effizienz der Spülung des Blutes in die Organe enthalten verringern kann.</li>
		<li>Durchspülen Sie das Herz mit 15 – 20 mL kaltem PBS mit einer 60 mL-Spritze mit einer Nadel 21 G ausgestattet und kaltem PBS. Vorsichtig fassen Sie die Basis des Herzens mit der Zange und Stechen Sie die Nadel in die linke Herzkammer in der Nähe der Spitze. Wiederholen Sie den Vorgang in der rechten Herzkammer. Eine korrekte Injektion führt zu weißen Lunge und Leber blass. Hinweis: Perfusion sollte durchgeführt werden innerhalb von 5 Minuten nach Sterbehilfe zur Vermeidung Blutgerinnung, die die Organe des Interesses mit zirkulierenden Zellen verunreinigen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Halten Sie die Basis des Herzens mit der Pinzette und sanft hochziehen Sie das Herz, dann lösen Sie mitten durch Schneiden die großen Lungenarterien und Venen, Aorta und der Herzbeutel Plünderung zu.
	<ol>
<li>Das Herz sanft halten das Herz zwischen Daumen und Zeigefinger in einem sauberen fusselfreien Papiertuch zu reinigen und die Vorhöfe und die Reste der großen Arterien und Venen und andere Verunreinigungen mit einer Pinzette abziehen. Hinweis: Stellen Sie sicher die Gesamtheit der Vorhöfe wird entfernt und keine andere Gewebe wie die Lunge oder Blutgefäße, vorhanden sind, da diese Gewebe ihre eigenen Wohnsitz Immunzellen haben. Die Lunge hat insbesondere eine großen Immunzelle Bevölkerung, die die kleinere Populationen innerhalb der Herzmuskel überdecken kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Legen Sie das Herz in einer 5 cm Plastikschale mit 50 µL kaltem PBS.
	<ol>
<li>Hacken Sie die Herzen mit gebogenen sezierenden Schere bis gibt es keine sichtbaren Stücke und es eine weiche Konsistenz hat. Hinweis: Versuchen Sie, das Herz in einem geschlossenen Bereich der Schale zu halten, beim Häckseln um Gewebeverlust zu minimieren.</li>
		<li>Thetrituratedheart Gewebe mit gebogenen Pinzette in 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 800 µL kalter Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hinzufügen von 450 U/mL Ofcollagenase I, 60 U/mL von Hyaluronidase Typ I-S und 60 U/mL der DNase-ich zu jeder Probe.
	<ol>
<li>Inkubieren Sie Proben bei 37 ° C auf einen rockigen Shaker bei 50 u/min für 45 – 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nach der Verdauung, kurz Wirbel Proben (20 s) und sofort auf Eis, Proben bei 4 ° c zu halten
	<ol>
<li>Mit Hilfe einer 1 mL-Pipette, pipette Proben rauf und runter bis Gewebeproben homogen sind und die PIPETTENSPITZE nicht verstopfen. Hinweis: Definieren eine bestimmte Anzahl von Wiederholungen, pipette kann Reproduzierbarkeit erhöhen. Wenn das Herz nicht optimal verdaut werden, können Teile des Myokard die Pipette behindern. Die PIPETTENSPITZE gegen den Microcentrifuge Schlauch vorsichtig Schleifen hilft, größere Stücke des Gewebes zu homogenisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vornässen Sie 40 µm Zelle Sieb auf ein 50 mL konische Röhrchen mit 1 mL kalte HBB gelegt.
	<ol>
<li>Der Filter homogenisierten Probe hinzu und langsam gießen 12 – 14 mL kalte HBB durch Waschen.</li>
		<li>Gefilterten Proben auf einem gekennzeichneten 15 mL konische Rohr übertragen und bei 4 ° c halten</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zentrifuge Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie überstand.
	<ol>
<li>Lyse von Erythrozyten durch Zugabe von 1 mL der Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer für jede Probe. Aufschwemmen Sie Proben durch aufschütteln und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Wenn Lyse abgeschlossen ist, fügen Sie 5 – 8 mL des kalten Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Hämolyse zu stoppen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben auf 400 X Gfor 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der FACS-Puffer zu jeder Probe und Transfer zu einem gekennzeichneten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinweis: Das Protokoll kann hier bis zu 2 h mit Proben bei 4 ° c gelagert pausiert werden</li>
</ol>(4) flow Cytometry Färbung und Analyse
<ol><li>
Zentrifuge Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C.
	<ol>
<li>Um unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren, zu verdünnen, 1: 100 Anti-CD16/CD32 und Monocyte-Blocker (01:20) (siehe Tabelle der Materialien) Bilanzierung von 50 µL FACS pro Probe. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.</li>
		<li>Bereiten Sie den Antikörper-Verdünnung (1: 250 für jeden Antikörper) entfielen 50 µL FACS pro Probe. Hinweis: Ein Lebensfähigkeit Farbstoff kann in der Antikörper cocktail aufgenommen werden, um abgestorbene Zellen auszuschließen. Alternativ kann die geringe Größe Ausschluss durch Flow-Analyse verwendet (Abbildung 1C und D).</li>
		<li>Ohne Waschen, fügen Sie 50 µL Antikörper-master-Mix zu jeder Probe und mischen.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jede Probe zu waschen und Zentrifugieren Sie Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° c fügen Sie 600 µL FACS hinzu</li>
	<li>Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Pellet in 300 µL FACS. Halten Sie Proben bei 4 ° C im Dunkeln. Hinweis: Einige Lebensfähigkeit Farbstoffe, wie z. B. DAPI, erfordern Färbung innerhalb von 10 min vor dem Ausführen der Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Analysieren von Durchflusszytometrie (siehe Abbildungen 1 und 2) innerhalb der nächsten 3 h. Wenn eine längere Zeit erforderlich, kurzfristigen Fixierung mit einer niedrigen Konzentration Paraformaldehyd ist (0,5 – 1 % mit PBS-Puffer) wird empfohlen, die Färbung zu erhalten. Hinweis: Es wird empfohlen, um Proben durch ein 40 µm Zelle Sieb vor initiieren Flow Cytometry Analyse zu filtern, zur Vermeidung von Verstopfung der Fluidik das Durchflusszytometer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Myokardiale Entzündung oder Herzmuskelentzündung (Myokarditis), ist ein Merkmal der meisten Herz-Kreislauf-Krankheiten. Der Herzmuskel ist jedoch nicht frei von eigener immun Komponenten in Krankheitszuständen. Im Steady-State viele Immunzellen befinden sich im Myokard und spielen die wesentliche Rolle der Wartung und Schutz. Die Charakterisierung dieser vielfältigen Populationen von Zellen wäre nicht möglich ohne Methoden wie dem präsentiert in diesem Protokoll gewesen.
Eine Kombinatio...

Verschiedene Formen der myokardialen Stress oder Verletzungen, einschließlich ischämische (Ischämie Reperfusion oder Myokardinfarkt) und nicht-ischämische (Hypertonie oder Myokarditis), fördern die Einstellung von Entzündungszellen mit reparative und schützend, sondern auch pathogenen Eigenschaften. Bereits im Jahr 1891, beschrieben Romberg erstmals das Vorhandensein von zellulären Infiltrate im Herzmuskel von Patienten mit Typhus und Scharlach1. Jedoch erforderlich der Detailstudie des kardialen Immunzellen die Entwicklung von fortgeschrittenen Immunphänotypisierung Techniken. Infolgedessen haben wir erst vor kurzem begonnen zu verstehen, dass eine vielfältige Bevölkerung von Immunzellen mit notwendigen Wartungs-Rollen während der Steady-State innerhalb der Herzmuskel befindet.
Histologie wurde und immer noch ist, die am häufigsten verwendete Methode, kardiale Immunzellen während einer Entzündung zu charakterisieren. Während Histologie ein wertvolles diagnostisches Instrument darstellt, hat seine Verwendung in der Studie von kardialen Immunzellen jedoch wichtige Einschränkungen. Die Immunzellen mit Wohnsitz im Myokard stellen einen sehr kleinen Teil der gesamten Zellen und sind mehr oder weniger gleichmäßig verteilt in einem verhältnismäßig großen Raum. Ähnlich, zeigen verschiedene Formen der kardialen Entzündung, wie virale Myokarditis, fokale Muster der Entzündung. Dies bedeutet, dass die genaue Analyse des Immunsystems des Herzens erfordern oft höhere Grade der histologischen Probenahme, Erhöhung der Kosten um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus bietet die Histologie eine sehr begrenzte Menge von brauchbaren Informationen in Zelle Identifikation (z.B. Anzahl der Parameter). Mit einer ständig wachsenden Zahl der Zelle Teilmengen, die mehrere Ausdruck Marker (einschließlich oberflächenmarker, Transkriptionsfaktoren oder abgesondert Moleküle) erfordert, hat sich Durchflusszytometrie als das mächtigste Werkzeug für die Immunphänotypisierung etabliert, aufgrund der Low-Cost und hohem Durchsatz.
Die Immunphänotypisierung Techniken richtet sich eng an der Entwicklung von effizienten Verdauung-Protokolle, die für einzelne Zellen Analyse einer großen Anzahl von Zellen erlaubt. Die Entwicklung der ausführliche Protokolle der Zelle Extraktion eröffnet ein neues Fenster der Möglichkeiten in der Studie von kardialen Immunologie. Durch die Kombination von Verdauung, Durchflusszytometrie und Transkriptom wurden die großen Populationen von Makrophagen und dendritischen Zellen, die ihren Wohnsitz im Herzen zeichnet sich2,3. Die am häufigsten vorkommende Bevölkerung von kardialen Immunzellen im Steady-State sind CD64++ MerTK Makrophagen, die weiter unterteilt werden können, basierend auf ihren Ausdruck CCR2 oder CD11c2. CCR2+ Makrophagen stammen aus Erwachsenen Knochenmark Hämatopoese, während die Mehrheit des CCR2– Makrophagen, die hohe oder niedrige Niveaus des MHC-II zum Ausdruck bringen können, sind vor allem pränatalen Ursprungs. Makrophagen führen Sie wichtige Funktionen wie Reparatur4 und Entfernung von Schmutz5 bei Verletzungen oder elektrische Verbindungstechnik6 im Steady-State zu unterstützen. Während verschiedene Formen von Entzündungen ein wichtige Zustrom von Ly6CHallo MHC-IIlo CD64Int Monozyten auftreten, zu unterscheiden, die später in Ly6CHallo CCR2+ Makrophagen2,7 . Eine deutlich kleinere, aber wichtige Population von Zellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von gesunden Personen besteht aus dendritischen Zellen8,9. Die zwei großen Teilmengen von kardialen herkömmlichen DCs (cDCs) wurden vor kurzem charakterisiert: cDC1 (CD103+ DCs) und cDC2 (CD11b+ DCs). DCs eine wichtige Rolle in der Verteidigung gegen Infektion8 aber auch Selbstverletzung während einer Entzündung, besonders bei Myokardinfarkt9fördern können.
Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung von lebensfähigen kardiale Immunzellen aus Maus Myokard. Die Methode kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung mit Zelle-Sieb Filtration um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, die analysiert oder durch Flow Cytometry sortieren oder magnetischer Wulst Bereicherung weiter gereinigt werden können. Genaue Messungen der extravascular Herzmuskelzellen erfordern kardialen Durchblutung um mögliche Verunreinigungen aus dem Blutkreislauf der kardiologische Microvasculature zu entfernen. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen einen optionalen Schritt des intravaskulären Kennzeichnung von Immunzellen, die verwendet werden, um weitere Herzmuskelzellen intravaskulären Verunreinigungen, basierend auf der Galkina Et Al. Protokoll10unterscheiden. Schließlich präsentieren wir eine grundlegende Flow Cytometry Analyse Ermittlung die wichtigsten Subpopulationen von Makrophagen und cDC.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Wisent</td><td>311-511-CL</td><td>1x HBSS</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter , 0.2 &amp;micro;m Filtropur V50</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.001</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 1 cc insulin syringe</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>60 mL syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>from Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Hyaluronidase type I-S</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>from bovine pancreas</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td><td>Lonza</td><td>10-546E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td><td>Biolegend</td><td>128025</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD103</td><td>Biolegend</td><td>121414</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PE anti-mouse Ly-6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td><td>Biolegend</td><td>116422</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td><td>Biolegend</td><td>139315</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103113</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>1:40 dilution</td></tr><tr><td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>True-Stain Monocyte Blocker</td><td>Biolegend</td><td>426101</td><td>1:20 dilution</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar Inc</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr><tr><td>Mouse: Batf3-/-</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX: 013755</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Das Immunsystem ist ein wesentlicher Bestandteil eines gesunden Herzens. Der Herzmuskel ist Heimat einer reichen Bevölkerung von verschiedenen Immunzellen Teilmengen mit funktionaler Aufteilung bei Steady-State und bei verschiedenen Formen von Entzündungen. Bis vor kurzem das Studium der Immunzellen im Herzen erforderte den Einsatz der Mikroskopie oder schlecht entwickelte Verdauung Protokolle, genügend Sensibilität während einer schweren Entzündung aber konnten nicht sicher identifizieren kleine-aber wichtige-Populationen von Zellen im Steady-State. Hier diskutieren wir eine einfache Methode kombinieren enzymatische (Kollagenase, Hyaluronidase und DNAse) und mechanische Verdauung der murinen Herzen vorangestellt intravaskulärer Verabreichung von eindringmittel radioaktiv markierten Antikörper gegen kleine unterscheiden aber unvermeidbar intravaskulären Zelle Verunreinigungen. Diese Methode erzeugt eine Aussetzung der isolierten lebensfähige Zellen, die durch Durchflusszytometrie zur Identifikation, Phänotypisierung und Quantifizierung analysiert oder weiter gereinigt mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder magnetischer Wulst Trennung für werden können transkriptionelle Analyse oder in-vitro- Studien. Wir sind ein Beispiel für eine schrittweise durchflusszytometrischen Analyse der wichtigsten Makrophagen und dendritischen Zellpopulationen des Herzens zu unterscheiden. Für eine mittlere Größe Experiment (10 Herzen) erfordert der Abschluss des Verfahrens 2 – 3 h.

Bislang wurde keine gute Methode entwickelt, um Immunzellen von anderen Herzmuskelzellen Bestandteilen, wie Kardiomyozyten zu isolieren. Daher erfordert eine Analyse der einzelnen Herzmuskelzellen Suspension durch Durchflusszytometrie Pre Anspritzung mit CD45, die immun Zellpopulationen, gefolgt von Einzelzellen und geringen Größe Ausgrenzung gating (Abb. 1A) zu identifizieren. Alternativ kann eine Lebensfähigkeit Färbung durchgeführt we...

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Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens

Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode, um zu isolieren, Identifikation und Quantifizierung von Immunzellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von Mäusen im Steady-State oder Entzündungen. Das Protokoll kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung zur Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die weiter durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Serie: Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Entwicklungsbiologie

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymaler Stromazellen Herzzellen von Endomyocardial bioptischen Proben von Arrhythmogenic Kardiomyopathie Patienten

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

Isolierung von Makrophagen-Teilmengen und Stromalzellen von Menschlichen und Maus-Myokardproben

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. However, the literature reports contrasting data on the prevalence of myocardial B-cells. B-cells have been reported to be both among the most prevalent immune cells in the rodent heart or to be present, but at a markedly lower prevalence than myeloid cells, or to be quite rare. Similarly, several groups have described that the number of myocardial B-cells increases after acute ischemic myocardial injury, but one group reported no changes in the number of B-cells of the injured myocardium. Implementation of a shared, reproducible method to assess the prevalence of myocardial B-cells is critical to harmonize observations from different research groups and thus promote the advancement of the study of B-cell myocardial interactions. Based on our experience, the seemingly contrasting observations reported in the literature likely stem from the fact that murine myocardial B-cells are mostly intravascular and connected to the microvascular endothelium. Therefore, the number of B-cells recovered from a murine heart is exquisitely sensitive to the perfusion conditions used to clean the organ and to the method of digestion used. Here we report an optimized protocol that accounts for these two critical variables in a specific way. This protocol empowers reproducible, flow cytometry-based analysis of the number of murine myocardial B-cells and allows researchers to distinguish extravascular vs. intravascular myocardial B-cells.

Here we report a protocol for the quantification and differentiation of myocardial B-lymphocytes based on their location in the intravascular or endothelial space using flow cytometry.

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung und Analyse von Myokard-B-Zellen

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolierung und Kultur residenter kardialer Makrophagen aus dem murinen sinoatrialen und atrioventrikulären Knoten

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Medizin

Enthüllung der myokardialen Architektur der Lungenvenen der Maus

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial fibrillation (AF). PVs contain myocardial sleeves (MS) composed of cardiomyocytes. MS are implicated in the initiation and maintenance of AF, as they preserve similarities to the cardiac working myocardium, including the ability to generate ectopic electrical impulses. Rodents are widely used and may represent excellent animal models to study the pulmonary vein myocardium since cardiomyocytes are widely present all over the vessel wall. However, precise microdissection and preparation of murine PVs is challenging due to the small organ size and intricate anatomy.
We demonstrate a microscopy-guided microdissection protocol for isolating the murine left atrium (LA) together with the PVs. Immunofluorescence staining using cardiac Troponin-T (cTNT) and connexin 43 (Cx43) antibodies is performed to visualize the LA and PVs in full length. Imaging at 10x and 40x magnification provides a comprehensive view of the PV structure as well as detailed insights into the myocardial architecture, particularly highlighting the presence of connexin 43 within the MS.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines translationalen Modells für die Speziesforschung zu Vorhofflimmern 

This protocol demonstrates microscopy-guided isolation and immunofluorescence staining of murine pulmonary veins. We prepare tissue samples containing the left atrium, pulmonary veins, and the corresponding lungs and stain them for cardiac Troponin T and Connexin 43.

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymaler Stromazellen Herzzellen von Endomyocardial bioptischen Proben von Arrhythmogenic Kardiomyopathie Patienten

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

Isolierung von Makrophagen-Teilmengen und Stromalzellen von Menschlichen und Maus-Myokardproben

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung und Analyse von Myokard-B-Zellen

Isolierung und Kultur residenter kardialer Makrophagen aus dem murinen sinoatrialen und atrioventrikulären Knoten

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen