Name: optogenetics identification of a neuronal type with a glass optrode in awake mice
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
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Unterstützt wurden die Autoren von der Japan Society for Promotion of Science KAKENHI Grant JP16K11200 und 17 H 02223 und der Zuschuss für die Forschung von Kanazawa Medizinische Universität S2016-8 und C2017-3. Wir danken Yuhichi Kuda für seine Unterstützung bei der Aufnahme der Fotos.

Alle Verfahren sind im Einklang mit den Leitprinzipien der physiologischen Gesellschaft von Japan und mit Zustimmung der Animal Care Ausschuss von Kanazawa medizinischen Universität durchgeführt.
(1) Bau von Optrode Glashalter
Hinweis: Um ein Glashalter Optrode zu bauen, eine kommerzielle Elektrodenhalter verwendet (Abbildung 1A).
<ol><li>Ziehen Sie das Stahlrohr für Druckregelung vorsichtig aus dem Faß des Inhabers.</li>
	<li>Durch Bohren, das Loch des Pin-Sitz-Seite in den Lauf des Inhabers zu erweitern. Machen Sie das Loch 3 mm im Durchmesser und 12 mm in der Tiefe.</li>
	<li>Setzen Sie ein Edelstahl-Rohr (Durchmesser 3 mm, 0,5 mm dick und 8 mm Länge; Abbildung 1A ( 2) in das Loch.</li>
	<li>Legen Sie eine Keramik Paarung Hülse für ⌀2.5 mm Ferrulen (Abbildung 1A1) in das Loch aufgeteilt.</li>
	<li>Befestigen Sie den Lauf des elektrodenhalters zu einem L-förmigen Falz mit Epoxy-Kleber.</li>
	<li>Machen Sie die Löcher (3 mm im Durchmesser) in den Falz und an einem Manipulator mit Schrauben befestigen.</li>
</ol>2. Leiter Post Installation
<ol><li>Bereiten Sie einen speziell angefertigten Kopf Beitrag gemacht der eine Leiterplatte Abstandhalter vor. Machen Sie den säulenförmigen Leiterplatte Abstandhalter in Form eines quaderförmigen mit einer Fräse und schneiden Sie es in 2 Kopf stellen mit einer Säge (Abbildung 1 b). Glätten Sie die Unterseite der Kopf Post mit einer Fräse.</li>
	<li>Bereiten Sie die transgenen Tieres, in denen eine lichtempfindliche Opsin in ein bestimmtes Neuron-Typ für die Studie zum Ausdruck kommt. In dieser Arbeit wird die transgenen Maus (VGAT-ChR2 Mäuse) in der hemmenden Neuronen Channelrhodopsin-2 (ChR2)11 Ausdrücken verwendet.</li>
	<li>Betäuben Sie das Tier mit einer Mischung von 0,3 mg/kg Medetomidine, 4,0 mg/kg Midazolam und 5,0 mg/kg Butorphanol durch intraperitoneale Verwaltung. Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist, testen Sie seine Reaktionen um die Rute einklemmen.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen. Sauberen pad der stereotaktischen Rahmen und die Heizung mit 70 % Alkohol im voraus. Stellen Sie die Zähne in das Loch von der Snack-Bar, und ziehen Sie die Nase Spannbacke leicht an. Befestigen Sie beide Seiten des Kopfes mit Ohr-Stangen. Wenn der Kopf richtig durch die Ohr-Balken befestigt ist, ziehen Sie die Nase Spannbacke an. Anwenden einer ophthalmologischen Salbe für die Augen.</li>
	<li>Rasieren Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere und Reinigen der Kopfhaut mit einem Wattestäbchen von Chlorhexidin Gluconat. Sterilisieren Sie vor der Operation alles, was, die der chirurgischen Instrumente und einen Kopf mit Autoklav (121 ° C, 15 min Posten).</li>
	<li>Die Kopfhaut entlang der Mittellinie mit einer Schere schneiden und zur Seite schieben. Den Schnitt von der Rückseite des Kopfes, der Augen (ca. 20 mm) zu machen. Entfernen Sie das Periost mit einem Wattestäbchen in 70 % Alkohol getaucht und trocknen Sie den Schädel.</li>
	<li>Legen Sie die Kopf Post auf der Manipulator. Positionieren Sie den Kopf Pfosten flach auf den Schädel um die Bregma mit der Manipulator.</li>
	<li>Mischen Sie das Monomer (4 Tropfen), Katalysator (1 Tropfen) und Polymer (1 kleiner Löffel) dental Zement auf einen kleinen Teller, der vorher im Kühlschrank gekühlt wird. Dental Zement (unter 1 g) legte die frontalen und parietalen Knochen des Schädels, die Kopf Post an den Schädel zu beheben.</li>
	<li>Nach der zahnärztliche Zement hart wird, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie eine antibiotische Salbe auf die Haut. Spritzen Sie Medetomidine Antagonist (0,3 mg/kg) und Antibiotika (Oxytetracycline; 20 mg/kg). Platzieren überwachen Sie die Maus auf das Wärmekissen in einem Käfig zu, bis er erwacht und schicken Sie es an einem Gehäuse-Käfig.</li>
	<li>Haus das Tier in einem einzelnen Gehäuse-Käfig mit einigen Bereicherung Gerät. Ändern der tierischen Papiers Betten täglich, um den Käfig sauber zu halten und eine Infektion verhindern. Überprüfen Sie sorgfältig, ob das Tier Anzeichen von Unwohlsein zeigt. Soweit Lidocain auf die Wunde Schmerzen vermutet wird. Verwalten Meloxicam oder Carprofen einmal alle 24 h für 48 h nach beide Leiter-Installation und Kraniotomie Operationen Post. Die lokale Lidocain zusätzlich gegeben werden kann, wenn die NSAR nicht ausreicht.
</li>
</ol>(3) Akklimatisierung
<ol><li>Akklimatisieren Sie (mindestens) zwei Tage nach der Erholung von der Narkose, die Tiere in den Kopf fixiert Zustand in der Aufnahme-Kammer. Führen Sie die Akklimatisierung Sitzungen für mindestens 5 Tage.</li>
	<li>Während der Akklimatisierung-Sessions legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer mit dem Kopf Beitrag an einer speziell angefertigten Klemme befestigt. Während der Sitzung, um Bewegung zu begrenzen Abdeckung des Körpers mit einem maßgeschneiderten Harz Halbschlauch (Abbildung 1), machte mit einem 3D-Drucker. Hinweis: Am 1. Tag, sollte die Akklimatisierung Session 5 min lang sein. Es wird dann täglich um 10, 20, 40 und 60 min für Tage 2, 3, 4 und 5, bzw. erhöht.</li>
	<li>Am Ende jeder Sitzung belohnen Sie dem Tier essen. Wenn das Tier ständig während der Akklimatisierung kämpft, beenden Sie die Sitzung.</li>
</ol>4. Kraniotomie
Hinweis: Nach der Akklimatisierung ist eine Kraniotomie über die Gehirnregion für die Aufnahme gemacht. Die Kraniotomie erfolgt in der stereotaktischen Rahmen unter Narkose, da mit dem Kopf Installation Posten. Die Post-operative Verfahren ist das gleiche wie die Leiter Installation Post.
<ol><li>Reinigen Sie vor der Kraniotomie den Schädel mit einem Wattestäbchen mit Chlorhexidin Gluconat und 70 % Alkohol.</li>
	<li>Kratzen Sie sorgfältig den Schädel über die Aufnahme-Website mit einem Zahnbohrer. Sobald die Knochen dünn genug ist, schneiden Sie es mit der Spitze des Skalpells und entfernen Sie es.</li>
	<li>Dental Zement um der exponierten Region gelegt, um den Schädel zu stärken.</li>
	<li>Decken Sie die exponierte Hirnareal mit Silikonkleber, nachdem der dental Zement hart wird. Nach der Operation verläuft wie in Schritt 2.8 beschrieben.</li>
</ol>5. elektrophysiologische Aufnahme
<ol><li>Lassen Sie das Tier, für mindestens 1 Tag nach der Kraniotomie vor der Durchführung der elektrophysiologischen Aufnahme erholen. Legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer, in der gleichen Weise, die es während der Akklimatisierung-Sessions gemacht wurde, wenn die Aufnahme beginnt.</li>
	<li>Glaspipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu machen (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm 90,0 mm lang) auf eine Elektrode Puller gezogen. Ihr Tipp-Durchmesser beträgt 2 – 3 µm, und ihr Widerstand ist 4 – 6 MΩ, wenn sie mit 10 mM PBS gefüllt sind. Die Länge der Elektrode ist 40-50 mm. In manchen Aufnahmen ergänzt, 2 % Neurobiotin 10 mM PBS.</li>
	<li>Die maßgeschneiderte Optrode Halter die gefüllten Glaspipette zuordnen.</li>
	<li>Die Glaspipette Ag-Cl beschichtet Silberdraht (0,2 mm im Durchmesser) umgesetzt. Verbinden Sie den Silberdraht mit ein Stift über eine dünne beschichtete Elektrokabel. Verbinden Sie die Pin mit der Headstage des Verstärkers Aufnahme.</li>
	<li>Die LWL-Patchkabel verbinden (Kern = 960 µm Verkleidung = 1.000 µm, NA = 0,63) mit einem Zirkonia zwinge (OD = 2,5 mm) nach der Paarung Hülse auf dem Optrode Halter Split. Drücken Sie die Patch-Kabel in die Hülse, bis die Spitze der zwinge am Ende die Glaspipette Kontakte. Die Patch-Kabel liefert das Licht (Wellenlänge = 465 nm) von LED. Das LED-Licht wird durch ein Einkanal-LED-Treiber gesteuert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Silikonkleber über die Kraniotomie. Put angewärmte Kochsalzlösung (38 ° C) auf der Oberfläche des Gehirns in regelmäßigen Abständen zu verhindern, dass die Gehirn Oberfläche Trocknen während der Aufnahme-Session. Falls erforderlich, entfernen Sie die Dura mit scharfen Pinzette.</li>
	<li>Legen Sie die Glaselektrode in das Hirngewebe mit einem Manipulator. Der elektrodenwiderstand zu überwachen, wenn sie eingefügt wird. Die Elektrode zu ersetzen, wenn der Widerstand niedriger ist als erwartet, da die Elektrodenspitze möglicherweise beschädigt. Suchen Sie in einer Tiefe von Interesse und isolieren Sie die Einheit Spikes durch die Tiefe in 2 bis 5 µm Schritten anpassen.</li>
	<li>Nachdem die Einheit isoliert ist, liefern Sie die LED-Leuchte und beobachten Sie die Reaktion auf die lichtreize.</li>
	<li>Notieren Sie die neuronalen Aktivitäten nach der Identifizierung der Zelltypen. Führen Sie die Aufnahmen für 2 – 3 h. Erfolgt die Aufnahme an aufeinander folgenden Tagen (maximal 2 Tage), decken Sie die Kraniotomie mit Silikonkleber. Wenn die Aufnahme beendet ist, und das Tier geopfert, die Kopf Post abrufen und steckte es in Aceton zu waschen und wiederverwenden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neural+circuits.">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li><li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons:+triumphs+and+challenges.">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. 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V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation.">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li><li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons.">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug in den Neurowissenschaften geworden. Es ist verwendet worden, für bestimmtes Neuron Typen in Vivo zu identifizieren sowie die Aktivitäten der spezifischen neuronalen Bahnen zu manipulieren. Die Klärung der neuronalen Aktivitäten der verschiedenen neuronalen Arten fördert das Verständnis des Mechanismus der neuronalen Schaltkreise. Hier haben wir eine Methode, um das Licht um die Aufnahme-Site durch eine Glaselektrode im IC von wach VGAT-ChR2 Mäusen zu liefern...

Das zentrale Nervensystem besteht aus verschiedenen Arten von Neuronen, die unterschiedliche Funktionen haben. Wie diese verschiedenen Arten von Neuronen innerhalb der neuronalen Schaltung funktionieren, ist eines der wichtigsten Anliegen in den Neurowissenschaften. In vielen Regionen des Gehirns war es jedoch unmöglich, die neuronalen Typen in in-Vivo -Aufnahmen der elektrischen Aktivitäten zu unterscheiden, denn es keinen klaren Unterschied in der elektrischen Spike-Signal selbst, mit einigen Ausnahmen gibt. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben einen Durchbruch1,2. Mit transgenen Tieren in der lichtempfindlichen Opsin (z.B.Channelrhodopsin-2) in bestimmten neuronalen Arten ausgedrückt ist, wurde es möglich, die neuronalen Arten effizient in in Vivo Aufnahmen3, 4,5,6. Bei diesen Tieren die Neuronen mit lichtempfindlichen Opsin sind durch lichtreize während der elektrische Aufnahmen geben aufgeregt, aber anderen Neuronen sind nicht. Opsin-positiven Neuronen, zeichnen daher leicht von anderen Neuron durch ihre Reaktionen auf Licht.
Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Als nicht-invasive Methode richtet das Licht oft von Oberfläche des Gehirns. Jedoch weil das Licht Stärke verringert während es Hirngewebe durchläuft, ist es schwer, die tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns zu stimulieren. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Elektrophysiologische Experimente wurden oft an narkotisierten Tieren durchgeführt, weil die Bewegung des Körpers Lärm in den Aufnahmen verursacht. Wie gut dokumentiert ist, ist jedoch Anästhesie bekannt, um die neuronalen Antworten7,8,9,10zu ändern. Daher ist es notwendig, wach Tiere zu nutzen, um neuronale Reaktionen ohne künstliche Effekte der Narkose zu studieren. Im Gegensatz zu den Experimenten mit narkotisierten Tieren werden die elektrophysiologischen Aufnahmen nach der Erholung von der Operation in den Experimenten mit wach Tieren durchgeführt. Während der Zeit zwischen der Operation und die Aufnahmen Gewebe Exsudat oft sammelt sich auf der Oberfläche des Gehirns und macht die optische Transparenz von der Oberfläche des Gehirns gering.
Hier beschreiben wir eine Methode um Monoblock-Aufnahmen aus einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.

<table><tbody><tr><td>Electrode holder</td><td>Molecular Device</td><td>1-HL-U</td><td>pipette holder for microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Ceramic split mating sleeve</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm ferrule</td></tr><tr><td>Circuit board spacer</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm long</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame for mice</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Stereotaxic instruments for mice</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manual manipulator</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Dental adhesive resin cement</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Low toxicity silicone adhesive</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long</td></tr><tr><td>Fiber-optic patch cord</td><td>Doric Lenses</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63</td></tr><tr><td>Connectrized LED</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA )</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA</td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Dual-stage glass micropipette puller</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Antibiotic ointment</td></tr><tr><td>Terramycin&amp;reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetracycline</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 mice</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Microelectrode amplifier</td></tr></tbody></table>

optogenetics identification of a neuronal type with a glass optrode in awake mice

Es ist ein wichtiges Anliegen in den Neurowissenschaften wie verschiedene Arten von Neuronen arbeiten auf neuronale Schaltkreise. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben die Identifizierung des neuronalen in in Vivo elektrophysiologischer Experimente in breiten Hirnregionen aktiviert. Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Jedoch ist es oft schwer zu Anregung Licht an den tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns liefern. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Hier beschreiben wir eine Methode um Spike Antworten auf das Licht von einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in den tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.

In Abbildung 2untersuchten wir die Auswirkungen der Werkzeugspitze ändern und die Länge der glaspipetten auf die Lichtleistung an der Spitze der Pipetten (Abbildung 2A-B). Die Lichtleistung wurde durch eine optische Leistungsmesser platziert 1 mm von der Spitze gemessen. Die volle Länge wurde auf 50 ± 2 mm eingestellt, wenn die Spitzengröße variiert während der Werkzeugspitze ändern bis 2,5 µm festgelegt...

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Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse

Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.7K Aufrufe.  Kanazawa Medical University. Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.

Serie: Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Verhalten

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Ein Leitfaden zur<em&gt; In vivo</em&gt; Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Direkte Visualisierung der Murine Rücken Cochlear Nucleus für optogenetische Stimulation der Hörbahn

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

Optogenetische Manipulation von neuronalen Schaltkreisen während der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

Optroden-Array zur simultanen optogenetischen Modulation und elektrischen neuronalen Aufzeichnung

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

Installation of Optical Windows in the Brain of Transgenic Mice to Image Neural Activities

Source: Lin, X., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56297">Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates the brain&#39;s neural activity recording through an optical window in transgenic mice. The mice express a fluorescent protein that enables the detection of neural activities. A small portion of the skull is carefully removed to install an optical window, and the skull is then covered with black cement to block light before imaging.

Installation von optischen Fenstern im Gehirn transgener Mäuse zur Abbildung neuronaler Aktivitäten

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse

Zusammenfassung

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