Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über Störungen in Signalnetzwerken zu beantworten, die Krebswachstum oder die Entwicklung von Resistenzen gegen bestimmte Therapien verursachen können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnelle und zuverlässige Rückmeldungen über den Phosphorylierungszustand mehrerer Netzwerke liefern kann, die häufig bei Krebs dereguliert werden. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von medikamentenresistenten Krebsarten, da die Identifizierung von Veränderungen und posttranslationalen Modifikationen Veränderungen in der Signaltransduktionswegaktivität aufklären kann.
Während diese Technik auf Phosphorylierung verwendet wird, Kann es auch verwendet werden, um andere post-translationale Modifikationen wie Glykosylierung und Ubiquitylierung zu betrachten. Beginnen Sie damit, über Nacht kultivierte Zellen dreimal gründlich zu spülen, wobei 10 Milliliter PBS darauf achten, alle PBS nach der letzten Wäsche zu entfernen. Als Nächstes fügen Sie das entsprechende Volumen des Lysepuffers aus dem Protein-Assay-Kit hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lösen.
Trituieren Sie die resultierende Zelllösung etwa 10 Mal, bevor Sie mindestens ein mal 10 auf die siebten Zellen in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen. Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit Schütteln. Dann laden Sie das Lysat in eine Spritze mit einer 27-Spur-Nadel und Aspirat und geben Sie die Probe 10 Mal, um die Zellmembranen zu scheren.
Wenn die Zellmembranen vollständig gestört sind, zentrifugieren Sie das Lysat und übertragen Sie den Überstand in ein neues 1,5 Milliliter-Rohr zur anschließenden Gesamtproteinquantifizierung nach Standardprotokollen. Um einen humanen Phosphokinase-Test durchzuführen, verwenden Sie zunächst eine flache Pinzette, um eine Arraymembran in jeden Bohrwert eines Vier-Well-Multi-Trays mit zwei Millilitern frisch zubereitetem Arraypuffer eins pro Brunnen mit der Anzahl der nach oben gerichteten Membranen zu platzieren. Beim Eintauchen verschwindet der Farbstoff auf der Membran.
Bedecken Sie das Tablett mit einem Deckel und bebrüten Sie die Membranen auf einem Schaukelplattform-Shaker 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Während dieser blockierenden Inkubation jede Lysatprobe auf eine Proteinkonzentration von 50 bis 100 Mikrogramm in einem maximalen Volumen von 334 MikroliterLysepuffer verdünnen und das Endvolumen der extrahierten Proteinprobe mit frischem Arraypuffer auf 1,5 Milliliter erhöhen. Als nächstes saugen Sie vorsichtig den Arraypuffer aus jedem Brunnen des Multi-Trays und bebrüten die Membranen mit 1,5 Millilitern Proteinprobe pro Brunnen über Nacht bei zwei bis acht Grad Celsius auf einem Schaukelplattform-Shaker.
Am nächsten Morgen jedes Array sorgfältig in einzelne Kunststoffbehälter mit 20 Milliliter Waschpuffer für drei 10-minütige Wäschen auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur übertragen. Nach der letzten Wäsche 20 Mikroliter des entsprechenden rekonstituierten Antikörpercocktails zu zwei Millilitern Arraypuffer, zwei pro Brunnen, hinzufügen und vorsichtig den unteren Rand jeder Membran auf ein Papiertuch bleichen, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen. Legen Sie dann jedes Array wieder in den entsprechenden Brunnen des Antikörperfachs und bedecken Sie das Tablett für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform.
Übertragen Sie am Ende der Inkubation jedes Array sorgfältig in einen neuen acht mal 11 Zentimeter großen Kunststoffbehälter mit 20 Milliliter Waschpuffer für drei 10-Minuten-Waschungen, wie gerade gezeigt wurde. Nach der letzten Wäsche einen Milliliter einer geeigneten Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Lösung in jeden Brunnen des Multi-Well-Trays geben und die Membranen für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in ihre entsprechenden Brunnen zurückbringen. Legen Sie am Ende der Inkubation jede Membran zwischen zwei Stücke von fünf Millimeter Filterpapier, um überschüssigePuffer zu entfernen und die getrockneten Membranen mit einer geeigneten Pferderettich-Peroxidase-Erkennungslösung für drei Minuten zu bebrüten.
Legen Sie die Membranen dann für die nachfolgende Bildgebung in einzelne klare Kunststoffplattenprotektoren. Um den Rezeptor-Tyrosinkinase-Ausdruck in jeder Probe zu bewerten, öffnen Sie die Bilder in einem geeigneten Bildverarbeitungsprogramm wie Bild J und wählen Sie Bearbeiten und Invertieren aus den entsprechenden Dropdown-Menüs aus, um die schwarzen Flecken auf dem weißen Hintergrund des Bildes in weiße Flecken auf einem schwarzen Hintergrund umzukehren. Verwenden Sie als Nächstes das Werkzeug Oval, um ein Paar weißer Punkte auf dem Punktfleck einzukreisen, und wählen Sie Analysieren und Messen aus, um automatisch ein neues Fenster zu öffnen, in dem die Werte für den ausgewählten Bereich angezeigt werden.
Platzieren Sie dann den Punkt des Mauspfeils in die Mitte des Ovals und ziehen Sie den kreisförmigen Bereich um den nächsten Punktbereich, bis alle Sehenswürdigkeiten gemessen wurden. In diesem repräsentativen Experiment wurden die Auswirkungen der Tyrosinkinase-Inhibitorresistenz auf Signaltransduktionswege in einer Kontrolle in drei Tyrosinkinase-Inhibitor-resistenten Zelllinien analysiert. Es wurden sechs Phosphoproteine mit Differentialaktivität ausgewählt und die relative Intensität für mehrere Kandidatenproteine in jeder Zelllinie bestimmt.
Wie die Heatmap zeigt, könnte dann eine semiquantitative Auslesung der Veränderungen der Proteinphosphorylierung wichtiger Signaltransduktionsproteine erzeugt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, mit gesunden und aktiv teilenden Zellen zu beginnen, da Stressoren Veränderungen in der Signaltransduktionswegaktivität induzieren können. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie digitale PCR und Immunoblotting verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. Veränderungen der Phosphorylierung zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führen?
Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher in der Krebsbiologie geebnet, grundlegende Veränderungen in der posttranslationalen Modifikation von Proteinen zu erforschen, die zum Aufkommen personalisierter Medizin für Krebspatienten führen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krebszelllinien extrem gefährlich ist, also achten Sie darauf, aseptische Techniken zu verwenden, Vorsicht beim Entsorgen von Schärfen und tragen Sie einen Labormantel zu jeder Zeit.
