Name: ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschung (15K 07147, 17K 07419) von JSPS (Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), ein Inamori Foundation Research Grant (auf HI) und das Programm der gemeinsamen Nutzung/Forschungsstelle für Entwicklungsstörungen Medizin bei Das Institut für Molekulare Embryologie und Genetik, Kumamoto Universität (HS). Wir danken Dr. Azusa Kamikouchi und Herr Daichi Yamada für ihre Hilfe im Umgang mit dem abbildenden System.

1. Vorbereitung des larvalen Gehirn Explantaten
<ol><li>Machen Sie eine bildgebende Kammer. Hinweis: Stabile Aufnahme erfordert, dass die Gehirn Explantaten angebunden werden. Hier ist eine günstige, handgefertigte bildgebende Kammer in die Ca2 + imaging-System verwendet.<ol>
<li>Mit Pinzette, kratzen Sie unten in der Mitte von einem Kunststoff Kulturschale (35 mm x 10 mm) erstelle ich eine delle für die ventralen Ganglion des larvalen Gehirns machen Montage einfacher (Schritt 1.3, Abbildung 1).</li>
		<li>Platzieren Sie mit einem Zahnstocher einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf beiden Seiten der delle und legen Sie einen Wolfram-Stab (0,125 mm Durchmesser, 6 bis 7 mm Länge) auf den Leim.</li>
		<li>Verwenden ein kleines Stück wiederverwendbare Kitt-wie Kleber, machen eine Ringmauer (10 mm im Durchmesser und 3 mm hoch) rund um die delle (Abbildung 1). Hinweis: Der Raum im Inneren der Wand wird später gefüllt werden mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH-Wert 7,4 ± 0,05 bei 25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tierische Vorbereitung Hinweis: Für das Kalzium Imaging, wird ein Indikator für Kalzium, GCaMP6s, in der Zelle Art von Interesse, ausgedrückt, häufig mit Kombinationen von gewebespezifischen GAL4 und FH-GCaMP6serreicht ist. Um sicherzustellen, dass das Signal durch den Kandidaten-Rezeptor vermittelt wird, drückt sich GCaMP6s auch in einen mutierten Rezeptor defekt.<ol>
<li>Wenn experimentelle Vergleiche für verschiedene Genotypen wie Wildtyp und Mutanten erforderlich sind, Altern Sie Spiel Test Larven zur Vermeidung von GCaMP6 Ausdruck Ebene Variationen und physiologischen Unterschiede aufgrund der Entwicklungsphasen.</li>
		<li>Halten Sie Eltern fliegen (30 fliegen für jedes Geschlecht) in einem kulturfläschchen mit standard fliegen Essen für 8 h zur Eiablage auf die Oberfläche der Lebensmittel ermöglichen. Kultur-Larven in der Masse unter einen 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 ° C und 60-70 % relativer Luftfeuchtigkeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissektion des larvalen Gehirns<ol>
<li>Bei 90-120 h nach der Eiablage (AEL) sammeln Sie Larven und waschen Sie sie mindestens 3 Mal mit destilliertem Wasser, anhaftende Speisereste zu entfernen.</li>
		<li>Ort eine Larve auf einem quadratischen 1,5-Zoll-Uhrglas gefüllt mit Eis kaltem PBS. Hinweis: Die nächsten beiden Schritte werden in diesem Uhrglas unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt.</li>
		<li>Verwenden Sie Zange, sanft den Mittelteil der Larve greifen. Verwenden Sie eine andere Zange zu greifen die Mund-Haken und ziehen die Mund Haken vorsichtig, um den vorderen Teil der Larve, enthält das Gehirn vom Rest des Körpers zu trennen. Hinweis: Alternativ können chirurgische Scheren verwendet werden.</li>
		<li>Halten Sie die vordere Spitze von Pinzetten und umkrempeln Sie die Larve. Entfernen Sie überflüssige Gewebe des Gehirns, z. B. Ring Drüse imaginalen Festplatten und Fett Körper befestigt. Trennen Sie vorsichtig das Gehirn aus der Mundwerkzeuge.</li>
		<li>Das Innere der Ring aus der Kitt-ähnliche wiederverwendbaren Klebstoff in der bildgebenden Kammer zuweisen Sie 200 µL PBS. Saugen Sie sezierten Gehirns mit PBS in einer Pasteurpipette sanft zu, und übertragen Sie es dann in die bildgebenden Kammer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einstellung des Gehirns in der bildgebenden Kammer<ol>
<li>Verwenden Sie die Zange, um Muskelfasern erstreckt sich von der ventralen Ganglien zu greifen. Legen Sie das Gehirn sanft in die delle unterhalb der wolframdraht.</li>
		<li>Eine andere Zange, ziehen den wolframdraht leicht bis zu platzieren das Gehirn an der richtigen Stelle für imaging (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Erwerb von Ca2 + Fluoreszenzbilder
Hinweis: Gehirn Explantaten inmitten der PBS sind abgebildet mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer 20 X Eintauchen in Wasser Objektiv ausgestattet (N.V. = 0,5). PBS wird nicht Zellen im Gehirn aktiviert. Wenn z-Bilder benötigt werden, ist das Objektiv mit einem Piezo-aktivierte Objektiv Mover montiert. Eine drehende Scheibe konfokale Kopf wird verwendet, um die zeitliche Auflösung zu verbessern. Für Low-Light-Bildgebung ist ein Elektron Multiplikation – Coupled Ladegerät Kamera am Mikroskop montiert. Die Darstellung der GCaMP6s Fluoreszenz (Anregung/Emission: 488/509 nm) erfordert einen 488 nm Laser Erregung mit ein dichroitischer Strahlteiler und eine Emission Filter (zB., 528 ± 38 nm Band Bandpass-Filter).
<ol><li>Ort der bildgebenden Kammer, die das Gehirn Explant unter die Lupe genommen.</li>
	<li>Senken Sie das Objektiv bis zum Anschlag der PBS. Positionieren Sie unter Hellfeld Beleuchtung das Gehirn und in den Vordergrund zu bringen. Wechseln Sie zu fluoreszierendes Licht und stellen Sie den Fokus auf die GCaMP6s-markierten Zellen. Hinweis: Die basalen grüne Fluoreszenz der GCaMP6s sollte sichtbar sein.</li>
	<li>Beginnen bei 250 ms/Rahmen bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel in wassergekühlten Modus mithilfe der entsprechenden Datenerfassungs-Software (zB., µManager). Passen Sie die Belichtungszeit um Fluoreszenz-Werte innerhalb des dynamischen Bereichs der CCD Kamera erhalten, aber nicht weniger als 1000 (willkürliche Einheiten), mit 16-Bit-Bilder (Dynamikumfang 0-65.535). Hinweis: Eine geringe Belichtungszeit sollte verwendet werden, um Foto-Bleichen von den GCaMP6s zu minimieren. Belichtungszeit sollte in jedem Experiment optimiert werden, da sie von den Ausdruck GCaMP6 und die Empfindlichkeit des Detection System abhängt. Es war 100 ms in unserem Experiment mit dilp2 > GCaMP6s. Wenn Z-Profile für eine bestimmte bildgebende Tiefe erforderlich sind, können mehrere Z-Abschnitt Bilder je nach der Belichtung Zeit und Frame Abständen erworben werden. Falls die Kamera genügend räumlichen Auflösung verfügt, sollte binning Größe (Anzahl der Register auf dem Chip, der in einem digitalen Pixel klassifiziert wird) erhöht werden, um die Belichtungszeit zu reduzieren.</li>
	<li>Nachdem bildgebende Parameter ermittelt wurden, nehmen Sie Bilder für 1 min vor der Verabreichung von Peptid, Grundlinie Signalintensitäten (F0) zu erkennen.</li>
	<li>Gelten Sie das Test-Peptid; Hierzu auflösen 100 µL peptidlösung mit PBS-Puffer und pipette es direkt in die Larven Wanne um eine optimale Konzentration zu erzielen. Hinweis: Sollte die peptidlösung langsam injiziert werden (z.B. Flow Rate 20 µL/s) in die Badewanne-Lösung mit einer Pipette. Unabhängigen synthetischen Peptid, aufgelöst in PBS dient als Negativkontrolle.</li>
	<li>Die Emission von GCaMP6s für ein paar Minuten aufzeichnen.</li>
</ol>(3) Datenanalyse
Hinweis: Imaging-Daten werden mit der ImageJ offline analysiert. Während die Zeitraffer-Bildgebung verursacht pipettieren der Larven Gehirn zu bewegen. Positionelle Aberrationen der seriellen Bilder sollten daher vor der Analyse korrigiert werden. Die Korrektur kann mit einem ImageJ-Plug-in, TurboReg wie folgt durchgeführt werden.
<ol><li>Öffnen Sie die Analysesoftware und verwenden Sie den ersten Frame (vor Peptid Anwendung) als ein Referenzbild.</li>
	<li>Wählen Sie Plugins | Anmeldung | TurboReg.</li>
	<li>Wählen Sie die serielle Image-Datei als Quelle und die Referenz-Bild als Ziel.</li>
	<li>Überprüfen Sie Rigid Body (Parallelverschiebung und Drehung der Bilder) und präzise ("Schnell" ist grob aber schnelle Analyse stattdessen) bzw. für die Verarbeitung und Qualität.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Batch um die Bildbearbeitung zu starten.</li>
	<li>Wählen Sie mehrere Regionen von Interesse (ROIs) mittels Analyse | Werkzeuge | ROI-Manager in ImageJ.</li>
	<li>Die Pixel-Intensität zu messen, indem Sie mehr auf | Multi-Maßnahme | OK im ROI-Manager-Fenster.</li>
	<li>Berechnen Sie ΔF/F0 = (F - F0) / f0, F ist die ROI-Intensität zum Zeitpunkt des Reizes, wobei F0 ist die Intensität auf ein Zeitfenster unmittelbar vor einem bestimmten experimentellen Ereignis (z. B. 30 frames vor dem Stimulus Onset).</li>
	<li>Wiederhole das Experiment mit mehreren Gehirn Proben, Durchführung von statistischen Verarbeitung um den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwertes (SEM) zu jedem Zeitpunkt zu erhalten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism.">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li><li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+food+intake.">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li><li>Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Ca2 + imaging hier beschriebene Methode ist ein nützliches System zum Testen der Funktion der Hormone im Gehirn. In-vivo, das Gehirn erhält Hormone von verschiedenen endokrinen Organen. Darüber hinaus sieht das Gehirn ständig aufsteigende sensorische Informationen, wodurch spontanen neuronalen Aktivierung. Diese ex-Vivo -System beseitigt wie Lärm und ergibt ein besseres Signal-Rauschverhältnis als in-Vivo Bildgebung. In diesem System können Moleküle einzeln oder in Kombin...

Orgel, Orgel-Kommunikation ist eine evolutionär konservierte Strategie für die Aufrechterhaltung der Homöostase um Veränderungen der Umwelt gerecht zu werden. Bei Menschen, eine Vielzahl von Hormonen Arereleased von den endokrinen Drüsen in den Blutkreislauf. Viele dieser Hormone gezielt im Hypothalamus des Gehirns, die Stoffwechselprozesse und grundlegende Verhaltensweisen wie Fütterung1,2regelt. Viele Hormone sind mit Säugetieren Modelle entdeckt worden. Die Mechanismen ihres Handelns, vor allem die interorgan Netzwerke, an denen sie teilnehmen, bleiben jedoch weitgehend unklar.
Drosophila Melanogaster hat ein nützliches Modell für das Studium der Orgel, Orgel-Kommunikation entwickelt. Bei Insekten sind viele physiologische Prozesse durch Hormone gesteuert. Frühe Studien mit Schwerpunkt auf Wachstum und Metamorphose verwendet große Insekten. In diesen Studien vorhergesagt die Entfernung oder die Transplantation von bestimmten Organen die Existenz von Inter Orgel Signalmoleküle; später wurden Juvenilhormon (JH), Prothoracicotropic Hormon (PTTH) und Ecdyson biochemisch gereinigten3,4,5. Eine große Familie von interzellulären Signalisierung Peptide wird gedacht, um während der Insekten Lebenszyklus6,7in verschiedenen physiologischen Ereignisse einbezogen werden. Die meisten dieser Peptide wirken auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), obwohl die spezifische GPCRs zunächst schwer zu identifizieren, mit herkömmlichen Ansätzen waren. Die Veröffentlichung der Drosophila ganze Genom-Sequenz8 war der Durchbruch, der die Identifizierung von Drosophila bioaktiven Peptiden basierend auf ihre Homologie mit denen in anderen Insekten aktiviert. Darüber hinaus wurden die Rezeptoren für verschiedene Peptide von GPCRs vorhergesagt im Genom mit Kultur-zellbasierte GPCR-Ligand verbindliche Tests identifiziert. Als nächstes vorhergesagt Expressionsanalysen die Orgel, Orgel-Wege ausgelöst durch diese Peptide und Rezeptoren. Insbesondere werden viele der vermeintlichen Peptid-Rezeptoren ausgedrückt im Gehirn, was darauf hindeutet, dass das Gehirn ein wichtiges Ziel von Peptid-Hormone-9. Darüber hinaus haben die genetische Sonderwerkzeuge in Drosophila zur Identifizierung der physiologischen Rollen von Peptid-GPCR Kombinationen beigetragen. Zum Beispiel ermöglichen die GAL4 und LexA binäre transkriptionelle basierenden gen-Knockdown oder Überexpression räumlich und zeitlich kontrolliert. GAL4, einen Transkriptionsfaktor identifiziert in Hefe, bindet an eine bestimmte Cis-regulatorische Sequenz genannt Upstream Aktivierung Sequenz (FH). In das GAL4/UAS-System die Treiber Line bietet gewebespezifischen oder Bühne-spezifische GAL4 Ausdruck und die Responder-Linie trägt UAS stromaufwärts des Gens von Interesse oder das Konstrukt Laufwerk ShRNA Ausdruck. LexA/LexAop System basiert auf einem ähnlichen Mechanismus. Phänotypische Analysen der gewebespezifischen Peptid-Zuschlag und gewebespezifische GPCR-Zuschlag Tiere können Informationen über die Peptid-GPCR Signalisierung Modus und Ort des Geschehens zeigen. Allerdings beschränken sich die Schlussfolgerungen, die allein durch genetische Daten erreicht werden können. Auf der anderen Seite sobald das vermeintliche Ziel ein bestimmtes Peptidhormon zu einem Gewebe oder Zellen Typ eingegrenzt, ex Vivo Kalzium imaging in Orgel Explantaten lässt sich die Orgel, Orgel-Kommunikation vermittelt durch Peptid-GPCR Signalisierung zu erhellen. Nach der Aktivierung eine Gq gekoppelt GPCR wird die intrazelluläre Ca2 + Konzentration durch die Freisetzung von Ca2 + aus dem ER10erhöht. Im Gehirn erhebt neuronalen Aktivierung auch die intrazellulären Ca2 + Ebenen. Diese Ca2 + Erhöhungen können durch eine Kalzium-Sensor, GCaMP, erkannt werden die Konformationsänderungen im Beisein von Ca2 + was Fluoreszenz Emission11erfährt.
In diesem Artikel wird ein Kalzium, die bildgebendes Verfahren mit Drosophila Gehirn explants beschrieben. Um die Fähigkeit eines Peptids, spezifische Neuronen aktivieren zu testen, wird eine Test-Peptid auf GCaMP exprimierenden Gehirn Explant angewendet und Fluoreszenz-Änderungen werden von konfokalen Mikroskopie überwacht. Die Einbeziehung der GPCR ist dann bestätigt, indem Sie den gleichen Test mit einem mutierten Gehirn fehlt der GPCR durchführen. Diese Kombination von Bildgebung und Genetik liefert präzise Informationen über die Orgel, Orgel-Kommunikation durch Peptide-GPCRs. möglich Änderungen und Anwendungen dieses Protokolls werden ebenfalls behandelt.

<table><tbody><tr><td>Tungsten rod</td><td>A-M systems, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paris, France</td><td>3049100</td><td>putty-like reusable adhesives</td></tr><tr><td>Watch glass, square, 1 5/8 in</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td>Phosphated buffered salts</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td><td></td><td>Custum-synthesized peptide</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Axio Imager A2</td><td>fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>420957-9900-000</td><td>water-immersion objective lens</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td><td>Physik Instrumente GmbH &amp;amp; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>N/A</td><td>piezoelectric-activated lens mover</td></tr><tr><td>Confocal Scanner Unit CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td><td>CSU-W1</td><td>spinning disc confocal head</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD camera</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>488-nm laser</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>dichroic beam splitter</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/38-25</td><td>emission filter</td></tr><tr><td>&amp;micro;Manager</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&amp;eacute;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

Orgel, Orgel-Kommunikation durch endokrine signalisieren, beispielsweise ist von der Peripherie zum Gehirn, unerlässlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase. Drosophila Melanogaster, die genetische Werkzeuge und Genominformationen anspruchsvoll ist, wird als Modell Tier für endokrine Forschung verstärkt eingesetzt. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für die Kalzium-Bildgebung von Drosophila Gehirn Explantaten. Diese Methode ermöglicht die Erkennung von der direkten Signalisierung eines Hormons im Gehirn. Es ist bekannt, dass viele Peptidhormonen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) handeln, dessen Aktivierung eine Erhöhung der intrazellulären Ca2 +Konzentration bewirkt. Neuronalen Aktivierung erhebt auch intrazelluläre Ca2 + Ebenen, von Ca2 + Zustrom und die Freisetzung von Ca2 + in das endoplasmatische Retikulum (ER) gespeichert. Ein Kalzium-Sensor, GCaMP, kann diese Ca2 + Änderungen überwacht werden. Bei dieser Methode wird GCaMP in den Neuronen des Interesses ausgedrückt, und das GCaMP mit dem Ausdruck ihrer Larven Gehirn seziert und kultiviert ex Vivo. Das Test-Peptid ist dann auf das Gehirn Explant angewendet, und die fluoreszierenden Änderungen in GCaMP werden erkannt mit einer drehenden Scheibe confocal Mikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet. Mit dieser Methode ein wasserlösliches Molekül kann getestet werden, und verschiedene zelluläre Ereignisse im Zusammenhang mit neuronalen Aktivierung können mit Hilfe der entsprechenden fluoreszierenden Indikatoren abgebildet werden. Darüber hinaus kann durch Ändern der bildgebenden Kammer, diese Methode verwendet werden, zum anderen Drosophila Organe oder Organe anderer Tiere Bild.

Unter Verwendung dieses Protokolls, wurde die Aktivierung des Gehirns Insulin-produzierenden Zellen (IPCs) durch das Peptidhormon, CCHa2, untersucht. IPCs des Wildtyp Gehirns wurden mit GCaMP6s beschriftet mit einer Kombination aus dilp2 -GAL412 (ein Geschenk von Dr. Rulifson) und FH-GCaMP6s13 (ein Geschenk von Dr. Kim). Larval Gehirn Explantaten mit einem synthetischen CCHa2 Peptid behandelt wurden, und die Fluoreszenz von...

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.2K Aufrufe.  Nagoya University. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Serie: Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurowissenschaften

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Immunologie und Infektion

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Überwachung epileptiformer Ereignisse in Drosophila mittels Calcium-Bildgebung

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autor im Rampenlicht: Einblicke in die Techniken und Erkenntnisse der jüngsten Fortschritte in der Epilepsieforschung 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
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Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Imaging Calcium in

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Mess physiologischen Reaktionen von

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität