Die Autoren haben nichts preisgeben.

(1) INS-1E Zellen: Wartung und Beschichtung
<ol><li>Pflegen Sie, INS-1E Zellen in einem befeuchteten 37 ˚C/5% CO2 Inkubator und kultivierten mit RPMI 1640 Medium mit 5 % (V/V) Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM Natrium Pyruvat, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin ergänzt Lösung, 50 µM β-Mercaptoethanol. Kulturzellen Sie in 10 mL komplette RPMI 1640 Medium (pro Platte), bis zum Zusammenfluss von 80-90 % erreichen, wenn sie trypsiniert und passagiert oder verwendet werden können für die Insulin-Sekretion-Assay.</li>
	<li>
Tag 1: Aspirieren Sie Medien und waschen Sie Zellen einmal mit 5 mL vorgewärmten PBS. Fügen Sie 0,5 mL Trypsin (0,025 %) verdünnt 1:1 in 0,5 mL PBS trypsinize Zellen und 3-4 min bei 37 ° c inkubieren. Deaktivieren Sie Trypsin, indem eine 15 mL Zentrifugenröhrchen durch pipettieren 9 mL komplette Medien und Transfer Zellen hinzufügen.</li>
	<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugation und erneut aussetzen der Zelle Pellet in etwa 5 mL frische Medien.</li>
	<li>Nehmen Sie 10 µL der neu suspendierten Zellen und mischen mit 10 µL Trypan blau vital Farbstoff für Zellviabilität zu überprüfen. Lebende und tote Zellen in 10 µL dieser Mischung mit einer Hemocytometer zu zählen. Lebensfähigkeit sollte über 90 % liegen. Verdünnen Sie die neu suspendierten Zellen in frische Medien auf 1 Million Zellen pro mL.</li>
	<li>0,5 mL INS-1E Samenzellen pro Bohrloch in einer Poly-L-Lysin vorbeschichtet 24-Well-Platte bei einer Dichte von 500.000 Zellen/gut.</li>
	<li>
Tag 2: Entfernen Sie die Medien 18-24 h nach der Beschichtung und 500 µL/Well frische RPMI 1640 Medien hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen für eine weitere 24 h damit Zellen vollständig von der vorherigen passaging Schritt zu erholen. Diese zusätzliche Zeit erlaubt die Zellen auf der Gewebekultur Platte verteilen.</li>
</ol>2. Insulin-Sekretion Assay (Tag 3)
<ol><li>KRB Puffer vorzubereiten: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5 mM Nahco33, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2und 0,001 g/mL Rinderserumalbumin (BSA), pH 7.4.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medien aus Zellen und zweimal mit vorgewärmten PBS waschen.</li>
	<li>Fügen Sie für den Glukose-Hunger-Schritt 450 µL/Well KRB (mit BSA) ohne Glukose für 1 h bei 37 ˚C/5% CO2.</li>
	<li>Während der Glukose-Hunger-Schritt vorzubereiten Verdünnungsreihen Gefäßsystem im KRB mit 200 mM Glukose (10 X-Konzentration).<ol>
<li>Bereiten Sie Medikament bei 10 x die Endkonzentration im KRB ergänzt mit 200 mM Glukose (auch 10 x die endgültige Assay-Glukosekonzentration vor). Wenn die Droge-Lager (plus die zusätzlichen 10 x Glukose) ist in DMSO, stellen Sie sicher, DMSO Prozentsatz Assay (idealerweise endgültige Prozentsatz von weniger als 0,1 % DMSO) konstant gehalten wird.</li>
		<li>Für Dopamin und Quinpirole Behandlungen, verwenden Sie einen abschließenden Test Medikament Konzentrationsbereich von 100 µM bis 100 pM (vom höchsten zum niedrigsten Konzentration), mit dem letzten Punkt der Dosis-Antwort enthält kein Medikament. Verwenden Sie für Bromocriptin einen abschließenden Test Konzentrationsbereich von 10 µM bis 22:00, mit dem letzten Punkt der Dosis-Antwort wird die wirkstofffreie Kontrolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie nach Glukose Hunger Medikament Verdünnungsreihen Assay, eine Dosis-Antwort zu produzieren hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL/Well jedes serielle Verdünnung in die entsprechenden Vertiefungen (total Assay Volume 500 µL).</li>
	<li>Zellen mit der jeweiligen Droge Verdünnungsreihen (in Anwesenheit von 20 mM Glukose) inkubieren Glukose Stimulation Schritt 90 min bei 37 ˚C/5% CO2. Eine Reihe von Kontroll-Vertiefungen enthalten: (1) Stimulation mit 20 mM Glukose allein in Ermangelung jeder zusätzliche medikamentöse und (2) Zellen, die weder mit Medikamenten noch Glukose (bietet eine basale Rate der Sekretion) stimuliert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Stimulation Schritt vorsichtig die Überstände (Verwendung direkt oder bei 4 ° c). Hinweis: Eine zusätzliche 5 min. sanfte Zentrifugationsschritt (600 X g, 1 min) kann an dieser Stelle eingeführt werden, um alle verbleibenden Zellen in der Assay-Überstände entfernen.</li>
</ol>3. HTRF, Maßnahme Insulin-Sekretion
<ol><li>Verdünnen Sie Assay Überstände 01:10 in KRB (ohne BSA), vorzugsweise in klaren 96-Well Platten.</li>
	<li>Bereiten Sie der Insulin-Standardkurve für HTRF Insulin Assay (Tabelle 1).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard-Stammlösung 500 ng/ml</td>
			<td>Verdünnungsreihen</td>
			<td>Arbeiten [Insulin] ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 7</td>
			<td>30 µl Lager + 140 µl KRB</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 6</td>
			<td>30 µl STD 7 + 45 µl KRB</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 STD</td>
			<td>30 µl STD 6 + 45 µl KRB</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 STD</td>
			<td>30 µl STD 5 + 45 µl KRB</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 STD</td>
			<td>30 µl STD 4 + 45 µl KRB</td>
			<td>3.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 STD</td>
			<td>30 µl STD 3 + 45 µl KRB</td>
			<td>1,54</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 STD</td>
			<td>30 µl STD 2 + 45 µl KRB</td>
			<td>0,61</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 0</td>
			<td>45 µl KRB</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Hinweis: STD Lager ist 500 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Verdünnungsreihen die Standardkurve Insulin zu machen.
<ol start="3"><li>Die HTRF-Platte die Standardkurve Proben und der verdünnten Probe Überstände hinzufügen. Die Messung des ausgeschiedenen Insulin durch HTRF kann erfolgen, in eine 96-Well oder einem 384-Well-Plattenformat, unter Berücksichtigung, die das Assay-Volumen muss neu eingestellt werden. Einsatz 10 µL/Well Probe in 96-Well weiße Hälfte-Bereich Platten oder 5 µL/Well in einem weißen 384-Well geringem Volumen, Rundboden Teller (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Antikörper-Mix in detektionspuffer vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) in einem 1:2 Spender (Cryptate) / Akzeptor (XL-665) Verhältnis. Hinweis: Weitere spezifische Details über die HTRF Probe sind beim Hersteller erhältlich.</li>
	<li>Der Test auf 30 µL/Well (für eine 96-Well-Platte-Assay-Format) oder 15 µL/Well (für ein 384-Well-Platte-Assay-Format) Antikörper-Mischung hinzufügen.</li>
	<li>Die Dichtplatte und bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Platte nach 2 h, 4 h und/oder Übernachtung Inkubation mit Antikörpern, die mit der Platte-Leser und die entsprechenden HTRF optische Modul zu lesen (337 665 620 nm) (siehe Tabelle der Werkstoffe und Anweisungen des Herstellers). Die Integration Start-bei 60 µs und die Integrationszeit bei 400 µs. Einsatz 200 blinkt pro Bohrloch. Hinweis: Diese Parameter beruhten auf den Einsatz unserer speziellen Leser. Das Auslesen bei 620 nm und 665 nm variieren zwischen verschiedenen Instrumenten. Dies ist einer der Gründe, warum wir empfehlen die Verwendung der 665/620-Verhältnis. Bei der Berechnung dieses Verhältnis, Potentialdifferenzen von Leser zu Leser werden normalisiert und konsistente Werte unabhängig von dem Instrument zur Messung der HTRF bieten.</li>
</ol>(4) Datenanalyse und Normalisierung
<ol><li>Berechnen Sie die Insulin-Konzentrationen der Assay-Brunnen durch Extrapolation der ratiometrischen Fluoreszenz Lesungen (665 nm/620 nm), eine zweite Bestellung quadratische polynomische Kurve (Abbildung 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> Abbildung 2 : Insulin Standardkurve. Humaninsulin Lager der bekannten Konzentrationen wurde verwendet, um die Standardkurve Insulin zu generieren. Die daraus resultierende HTRF Verhältnisse (665 nm / 620 nm) wurden gegen die Insulin-Konzentrationen aufgetragen. Die Daten am besten passte, eine zweite Bestellung quadratische polynomische Kurve (R2 = 0.99996). Dies ist eine repräsentative Standardkurve. Fehlerbalken = SEM <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"><li>Normalisieren Sie mit den hochgerechneten Daten wie ng/mL Insulin sezerniert (Insulin abgesondert in Reaktion auf die steigende Konzentrationen Liganden) auf den Mittelwert der % maximale Insulin-Sekretion Assay Brunnen (20 mM Glukose allein Zustand).</li>
	<li>Verwenden Sie die Kurve Passform (R2) aus einem einzigen Experiment um Intraplate Variation zu berechnen. Im Rahmen des Experiments R2 Einzelwerte von Intra experimentelle Duplikate, so dass die Berechnung der Standardfehler des Mittelwerts für die Kurvenanpassung abgeleitet.</li>
	<li>Verwenden Sie für die Bestimmung der interplate Variation die Daten aus mindestens drei einzelnen Experimente um den Standardfehler des Mittelwerts für die R-2 -Wert der kollektiven Kurve berechnen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

Wir danken Nicolas Pierre (Cisbio Bioassays) für hilfreiche Ratschläge und Dr. Pierre Maechler (Universität Genf) für die großzügige Bereitstellung von INS-1E Zellen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung aus dem Department of Defense (Grant PR141292, Z.F.), John F. und Nancy A. Emmerling Fund of The Pittsburgh Foundation (Z.F.).

Die hier beschriebenen HTRF Insulin Assay bietet eine schnelle, effiziente System zur Messung der Insulin-Sekretion aus einem kultivierten Zell-basierte System. Einer der wichtigsten Vorteile bietet dieser Test eine geringe Hintergrundsignal aufgrund der hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass das HTRF-Signal über einen längeren Zeitraum hinweg stabil ist (> 24 h)7. Dennoch, da die Insulin-Bindung monoklonaler Antikörper schnell bindende Sättigung nach Zugab...

Die Verordnung des Energiestoffwechsels ist durch ein großen anabole Hormon Insulin verfeinert. Insulin ist synthetisiert und von pankreatischen Betazellen in Reaktion auf erhöhte extrazelluläre Blutzuckerwerte veröffentlicht. Das freigesetzte Insulin löst die Aufnahme von Glukose durch Insulin-empfindlichen Gewebe1,2. Physiologisch ist dies auf die Höhe der Glukosekonzentration nach einer Mahlzeit, gefolgt von Sekretion von Insulin, Glukoseaufnahme Regeln verbunden. Störungen in Glukose Homöostase zu metabolische Beeinträchtigungen bis hin zu Insulinresistenz führen und letztlich bei der Entstehung von Typ-2 Diabetes2,3,4.
Obwohl die Insulinsekretion ausgiebig untersucht wurde, bleiben seine Regulationsmechanismen schlecht verstanden. Ein kritischer Bereich Untersuchung wurde Identifikation von neuartigen Modulatoren der Insulin-Sekretion von Beta-Zellen5,6,7,8. Diese Studien erfordern ein besseres Verständnis der Kupplung Beziehung zwischen Stimulation von Glukose und Insulin-Sekretion. Daher ist die Fähigkeit, genau zu überwachen und zu quantifizieren, das Niveau der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) unerlässlich gewesen. Bisher wurden jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Methoden zur Quantifizierung der GSIS mit Insulin-sezernierenden Zelllinien und/oder pankreatischen kleinen Inseln. Einer ist Radioimmunoassay (RIA), das Radioisotop-Tags Insulin und Antikörper verwendet. Die wichtigsten Einschränkungen dieses Ansatzes umfassen Fragen der Sicherheit durch die Handhabung und Entsorgung von radioaktiven Stoffen. Darüber hinaus ist diese Methode arbeitsintensiv, mit mehreren langen waschen und inkubationsschritte. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) ist ein weiterer Kosten- und arbeitsintensive Ansatz, der Antikörper gegen Insulin-Erkennung nutzt. Veränderung des Antikörpers Affinitäten und der Effizienz von Insulin zu erkennen sind limitierende Faktoren dieser Methode und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen können. ELISA weder RIA wurde für Hochdurchsatz-Experimente entwickelt. AlphaScreen ist ein homogenes Assay verwendet für die Erkennung und Messung der Insulin-Sekretion. AlphaScreen Technologie basiert auf der Umwandlung von ambient Sauerstoff in einem aufgeregt Sauerstoff Singulett-Zustand, die mit Chemilumineszenz Arten, was die Generation der Chemilumineszenz reagieren kann. Da die Probe homogen ist, entfallen viele der Waschschritte RIA und ELISA zugeordnet. Die Instabilität des Signals aufgrund der Art der Reaktion ist jedoch ein limitierender Faktor, der die Ablesung des Tests beeinflussen kann. () TR-Zange, entwickelt von Heyduk und Kollegen9, ist ein weiterer homogenen Ansatz zur Insulin-Messung basiert auf der Bindung von zwei separaten Antikörper gegen unterschiedliche Epitope auf die Insulin-Molekül. Die Antikörper sind jedes chemisch mit Doppel stranded DNA mit kurze ergänzende einzelne stranded DNA Überhänge. Bindung von Antikörpern an Insulin bringt sie zusammen und führt zu ein Doppel stranded DNA Duplex. Jeder Antikörper ist auch verbunden mit einer jeweiligen Spender oder Akzeptor Fluorophor, und der Verband der DNA Duplex vereint diese Fluorophore, Förster Resonanz Energietransfer (FRET) zu generieren. Eine mögliche Einschränkung der TR-Zange, liegt jedoch bei den Bund selbst. Die Unfähigkeit, schnell zerstreuen Hintergrundfluoreszenz während der Bund Reaktion führen zu relativ hohen Hintergrundfluoreszenz und ein low-Signal Rauschabstand innerhalb der Assay. Daher besteht ein Bedürfnis nach wie vor für eine zuverlässige, robuste und kostengünstige Assay zur Quantifizierung der GSIS in gewissem Sinne Hochdurchsatz.
Jüngste Fortschritte in der Biophysik gipfelten in der Entwicklung eines homogenen Zeitaufgelöste Fluoreszenz Energie Resonanz Transfer (HTRF) basierte Assays. Insbesondere während der Energietransfer innerhalb kann der Assay als FRET-basierte, genauer gesagt, bezeichnen HTRF Lumineszenz Energie Resonanz Transfer (LRET)10 abhängig von der nichtstrahlenden Übertragung von Energie zwischen Donor und Akzeptor Art11,12,13. Diese Unterscheidung ist wichtig, da der Zeitpunkt für eine Fluoreszenz oder Abschreckung basiert Bund Interaktion ist viel anders als bei LRET, obwohl die gleichen Arten von gating für Bund und LRET verwendet werden können. Darüber hinaus die Verwendung von seltenen Erden lanthanid Cryptate Verbindungen wie Europium oder Terbium Cryptate in HTRF produziert lange Fluoreszenz Halbwertszeiten12,14. Dies bietet den einzigartigen Vorteil der Einführung einer zeitlichen Verzögerung (µsec) zwischen Spender Erregung und die Messung der Emission von den Akzeptor (d. h. Zeitaufgelösten Assay). Diese zeitliche Verzögerung ermöglicht ausreichend Zeit für die Hintergrundfluoreszenz, vor der Messung der Akzeptor Emission Fluoreszenz zu zerstreuen. Infolgedessen das Auslesen ist frei von unspezifischen Fluoreszenz und damit ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist (Abbildung 1). Darüber hinaus entfallen homogene Artder HTRF Waschschritten ungebundenen Arten, so dass des Tests viel schneller als ELISA oder RIA-basierten Methoden abwaschen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische des Mechanismus der Insulin-Erkennung HTRF. Zwei unabhängig generierten monoklonale Antikörper spezifisch erkennen und Binden an Insulin an verschiedenen Standorten. Diese Antikörper sind entweder dem Europium Cryptate Spender oder den XL665 Akzeptor konjugiert. Anregung des Spenders auf 337 nm Ergebnisse in Emission bei 620 nm. Die daraus resultierende Energieübertragung bewirkt XL665 emittieren bei einer längeren Wellenlänge, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines HTRF ausgerichteten Ansatzes an der GSIS aus INS-1E Zellen bestimmen, eine gut etablierte Insulin-sezernierenden Beta-Zellen abgeleitet Ratte Insulinom Zelle Zeile15. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, für die Ermittlung der pharmakologischen Profils der molekularen Regulatoren der Insulin-Sekretion. Wir wenden dieses HTRF-basierte Insulin-Assay untersuchen Dopamin D2-Rezeptor Regulierung der GSIS mag. Immer mehr Studien haben gezeigt, dass der Neurotransmitter Dopamin ein wichtiger Regulator der GSIS8,16,17,18,19,20, ist 21 , 22. Dopamin wirkt GSIS in gewissem negativen Autokrine/Parakrine über Aktionen auf dem Dopamin D-2-Rezeptoren (D2, D3, D-4 -Rezeptoren) an der Oberfläche der Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse8 zum Ausdruck gebracht, wie , 16 , 19. mit dieser Assay, wir bestätigen Dopamin die Rolle als negativer Regulator der GSIS und nachweisen, dass die Dopamin D2-wie Rezeptor-Agonisten Bromocriptin und Quinpirole auch GSIS reduzieren.

<table><tbody><tr><td>96-well white half area plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384-well white low-volume, round-bottom plate</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>Insulin High Range Kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&amp;nbsp;</td><td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>To seal plate while antibodies incubate</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Dopamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Bromocriptine mesylate</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-Quinpirole hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

Die Erkennung der Insulin-Sekretion ist entscheidend für erhellendes Mechanismen der regulierten Sekretion sowie wie in Studien des Stoffwechsels. Obwohl zahlreiche Insulin-Assays für Dekaden bestanden haben, hat die jüngsten Aufkommen der homogenen Zeitaufgelösten Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) Technologie diese Messungen deutlich vereinfacht. Dies ist eine schnelle, kostengünstige, reproduzierbare und robuste optische Assay abhängig, Antikörper konjugiert, helle Fluorophore mit lang anhaltende Emission, die Zeitaufgelöste Förster Resonance Energy Transfer erleichtert. Darüber hinaus ist HTRF Insulin Erkennung für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Screening-Assays. Hier verwenden wir HTRF, um Insulin-Sekretion in INS-1E Zellen, eine Ratte Insulinom abgeleitet Zell-Linie zu erkennen. Dies ermöglicht es uns, basalen Ebenen von Insulin und deren Veränderungen in Reaktion auf die Stimulation der Glukose zu schätzen. Darüber hinaus verwenden wir diese Insulin-Detection-System, um die Rolle von Dopamin als negativer Regulator der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) zu bestätigen. In ähnlicher Weise, anderen Dopamin D2-wie-Rezeptor-Agonisten, Quinpirole und Bromocriptin, GSIS Konzentration abhängig zu senken. Unsere Ergebnisse zeigen das Dienstprogramm des Formates HTRF Insulin-Test bei der Bestimmung der Rolle von zahlreichen Medikamenten im GSIS und ihre pharmakologische Profile.

Wir validiert unsere Insulin HTRF Assay durch die Erzeugung eines Insulin-Standardkurve mit gereinigtem Humaninsulin Standards der vordefinierten Konzentrationen (Abbildung 2). Generation der Standardkurve erlaubt uns, die ratiometrischen Fluoreszenz Lesungen zu extrapolieren und somit bestimmen die sekretierten Insulinspiegel in Reaktion auf die medikamentöse Behandlungen (Abbildung 2). Intraplate Variante für Kurvenanpassung ...

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Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Hier präsentieren wir homogene Zeitaufgelöste FRET (HTRF) als effiziente Methode zum Schnellnachweis von Insulin aus den Zellen abgesondert.

Homogene Zeitaufgelösten Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Test zur Erkennung von Insulin-Sekretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

homogeneous-time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-based

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K Aufrufe.  University of Pittsburgh. Hier präsentieren wir homogene Zeitaufgelöste FRET (HTRF) als effiziente Methode zum Schnellnachweis von Insulin aus den Zellen abgesondert.

Serie: Homogeneous Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Forschung

Biochemie

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. Screening peptides affords an additional layer of complexity as conventional tip-based sample handling methods expose peptides to a large surface area of plasticware, providing an increased opportunity for peptide loss via adsorption. Preventing excessive exposure to plasticware reduces peptide loss via adherence to plastics and thus minimizes inaccuracies in potency prediction, and we have previously described the benefits of non-contact acoustic dispensing for in vitro high-throughput screening of peptide agonists1. Here we discuss a fully integrated automation solution for non-contact acoustic preparation of peptide serial dilutions in microtiter plates utilizing the example of screening for peptide agonists at the mouse glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Our methods allow for high-throughput cell-based assays to screen for agonists and are easily scalable to support increased sample throughput, or to allow for increased numbers of assay plate copies (e.g., for a panel of more target cell lines).

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS-fähigen Nichtinvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Biotechnik

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

Zeitaufgelöste Förster-Resonanz-Energietransfer-Assays zur Messung von endogenen phosphorylierten STAT-Proteinen in menschlichen Zellen

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

Entwicklungsbiologie

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Immunologie und Infektion

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biologie

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

Messung der relativen Insulinsekretion mit einem co-secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Intrazelluläre Signalereignisse und Hormonsekretion in menschlichen Pseudoinseln

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Inselanomalien und -funktionen mit einem Pseudoislet-Protokoll 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Homogene Zeitaufgelösten Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Test zur Erkennung von Insulin-Sekretion

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

FIBS-fähigen Nichtinvasive Metabolic Profiling

Zeitaufgelöste Förster-Resonanz-Energietransfer-Assays zur Messung von endogenen phosphorylierten STAT-Proteinen in menschlichen Zellen

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

Messung der relativen Insulinsekretion mit einem co-secreted Luciferase Surrogate

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile