Wir bedanken uns bei Laura Denti, Valentina Senatore und die Mitarbeiter des Referats biologische Ressourcen am UCL Institute of Ophthalmology für Hilfe bei Maus Haltung und Camille Charoy für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Medical Research Council (MR/N011511/1), C. Ruhrberg und eine British Heart Foundation PhD-Zugehörigkeit, j.t. Brash (FS/13/59/30649) unterstützt.

Alle tierische Arbeit erfolgte nach UK Home Office und institutionellen Richtlinien für Tierschutz und ethische Bewertung Körper (AWERB).
1. Maus Vorbereitung
Hinweis: Führen Sie Experimente an Erwachsenen Mäusen von mindestens 8 Wochen alt, bis zu 6 Monate alt. Nachweis der technischen Reproduzierbarkeit und konsequente Timing für jeden Schritt dieses Verfahrens zwischen verschiedenen Tieren verwenden Sie mindestens 2 und maximal 6 Mäuse für jede experimentelle Sitzung. Um den Effekt einer Mutation auf einer Durchlässigkeit auslösende Substanz in gentechnisch veränderten Mäusen zu bewerten, im Idealfall verwenden Sie 2 mutierte Mäuse und 2 stellt Steuerelemente pro Experimente.
<ol><li>24 h vor dem anregenden vaskuläre Hyperpermeability betäuben Mäuse mit einem geeigneten einatmen wie Isoflurane Narkose. Verwenden Sie 3 % Isofluran für Anästhesie Induktion, bis der aufrichtenden Reflex verloren ist und die Maus auf äußere Reize reagiert. 1,5 % Isofluran für Anästhesie Pflege verwenden (stellen Sie sicher, dass die Maus verfügt über Konstante Atemfrequenz). Rasieren Sie unter Narkose sorgfältig beide Flanken des jede Maus mit einen elektrischen Rasierer, Vermeidung von Verletzungen der Haut. Hinweis: Anästhesie wird verwendet, um zu vermeiden, verursacht Stress für das Tier und Bewegung während der Rasur, die Hautschäden führen können, zu minimieren.</li>
	<li>Die rasierte Maus in seiner Heimat Käfig zurück. Für männliche Mäuse legen jedes Männchen in einen einzelnen Käfig nach Narkose Erholung verhindern kämpfen und somit die Haut zu beschädigen. Kehren sie bei weiblichen Mäusen in einer Gruppe an ihrem Hause Käfig. Hinweis: Wenn eine Kampf Verhalten unter den männlichen Mäusen im Käfig beobachtet wird vor dem Eingriff, trennen Sie diese in einzelne Käfige für 3 Tage vor dem Test zu möglichen Hautschäden zu heilen zu lassen.</li>
	<li>Überwachen Sie die Mäuse, bis sie Bewusstsein (in der Regel innerhalb weniger Sekunden) zu erholen und des Käfigs (in der Regel innerhalb von 1 min. bewegen).</li>
</ol>(2) intravenöser Injektion von Evans blau färben
<ol><li>Bereiten Sie in einem Laminar-Flow Kabinett separate sterile Lösungen von Histamin-Inhibitor Pyrilamine Maleat (4 µg/µL in 0,9 % Kochsalzlösung) und Evans blau färben (1 % w/V in 0,9 % Kochsalzlösung). Sterilisieren Sie, indem man die Lösungen durch ein 22 µm-Filter.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile 1 mL Spritze mit einer 30 G-Nadel, um intraperitoneal jede Maus mit 10 µL Pyrilamine Maleat Lösung/Gramm Körpergewicht (Abbildung 1A) zu injizieren. Die Injektion, erste, Genick der Maus durchführen und dann zu kippen, so dass der Kopf sich auf den Boden richtet und der Bauch nach oben gerichtet ist. Spritzen Sie in die unteren Quadranten des Abdomens Weg von der Mittellinie zu vermeiden, dass die Blase. Hinweis: Das Gewicht der Mäuse zwischen 8 Wochen und 6 Monate alt werden in der Regel bewegt sich zwischen 15 und 30 g. Pyrilamine Maleat der Freisetzung von endogenen Histamin zu hemmen, die ansonsten vaskulären Leckage unabhängig von den Agenten zu prüfenden fördern würde.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einer Wärmekammer 37 ° C für 10 min Vasodilatation zu fördern. Alternativ können Sie eine passende Wärmelampe konzentrierte sich auf das Heck Vasodilatation zu fördern, wenn die Verwendung einer Wärmelampe durch die lokalen ethischen Richtlinien zulässig ist.</li>
	<li>Eine Maus zu einem Zeitpunkt zu einer Maus Restrainer und reiben Sie die Rute mit 70 % Ethanol, reinigen Sie die Injektion und Vasodilatation weiter zu fördern.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile 1 mL Spritze mit einer 30G-Nadel 100 µL verwalten Evans blauen Farbstoff intravenös über die Rute Vene (Abbildung 1 b). Sofort Druck auf die Einstichstelle durch halten der Rute zwischen dem Finger und den Daumen, um Blutungen zu verhindern. Hinweis: Visualisierung der Schweif Vene kann durch die Leitung der Lampenlicht zum Bereich Injektion verbessert werden. In einer veröffentlichten Protokoll18finden Sie weitere Einzelheiten zur Durchführung intravenöser Injektionen in die Vene Maus Schweif.</li>
	<li>Lassen Sie den Farbstoff für 30 min zirkulieren.</li>
</ol>3. stimulieren Sie vaskuläre Hyperpermeability
<ol><li>Mit sterilen Lösungen in einem Laminar-Flow Kabinett, verdünnen des Durchlässigkeit-induzierende Agents von Interesse zu einer Konzentration, die die letzte Dosis in einem Volumen von 20 µL geliefert werden kann. Hinweis: Im Beispiel Experiment gezeigt in der Abbildung 1-Abbildung 2, VEGFA verwendet wird, um vaskuläre Hyperpermeability in einer Konzentration von 2,5 ng/µL in PBS, stimulieren nachgeben einer Gesamtdosis von 50 ng und PBS eine Fahrzeugkontrolle dient als.</li>
	<li>Laden Sie die Durchlässigkeit-induzierende Agent des Interesses und der Fahrzeugsteuerung in 2 separate sterile 300 µL Spritzen mit einer 31 G-Nadel. Laden Sie ausreichende Lösung für jede Maus mit 20 µL der Lösung in dreifacher Ausfertigung zu injizieren (d.h. bereiten 60 µL des Agenten und Fahrzeug pro Maus plus zusätzliches Volumen, um die Nadel Totvolumen zu berücksichtigen).</li>
	<li>Betäuben Sie die erste Maus mit Isofluran (3 % für die Induktion der Anästhesie bis aufrichtenden Reflex verloren geht und die Maus auf äußere Reize reagiert und 1,5 % für Anästhesie Pflege, um sicherzustellen, dass die Maus verfügt über Konstante Atemfrequenz) getestet werden.</li>
	<li>Mikrodialysemembranen Spritzen Sie 20 µL des Förderung der Durchlässigkeit Agenten in die Flanke der Maus (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Nadel in einem Winkel von 15° auf der Haut ist. Überprüfen Sie für die Bildung einer erhöhten Blase innerhalb der Haut, die eine erfolgreiche Injektion angibt. Wiederholen Sie die intradermale Injektion 2 zusätzliche Standorte, eine mindestens 1 cm auseinander.</li>
	<li>Schalten Sie die Maus zu entlarven die 2. Flanke und dreifacher Injektionen mit der Kontrolllösung Fahrzeug zu wiederholen. Nehmen Sie Stellung der jede Injektionsstelle zu erleichtern die Identifikation für die anschließende Sammlung von Hautproben auf Papier auf. Hinweis: Griff die Maus Haut mit Vorsicht in diesem Stadium; vermeiden Sie zum Beispiel die Haut kneifen, wenn intradermale Injektionen durchführen.</li>
	<li>Zurückkehren Sie die injizierte Maus zu seinem Hause Käfig und überwachen Sie die Maus zu, bis es kommt wieder zu sich (in der Regel innerhalb von ein paar Sekunden) und bewegt sich um den Käfig.</li>
	<li>Während die ersten Maus erholt, sofort wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.5 mit der zweiten Maus und so weiter (bis zu 6 Mäuse maximal pro Sitzung). Notieren Sie sich die Zeit, die jede Maus injiziert wurde, passen Sie die Zeit, um zum nächsten Schritt übergehen.</li>
</ol>(4) Quantifizierung der kumulierten Evans blau innerhalb der Dermis
<ol><li>Keulen Sie jede Maus durch zervikale Dislokation 20 min nach Erhalt die intradermale Injektionen, Beobachtung der gleichen Reihenfolge in der die Mäuse injiziert wurden. Hinweis: Die Dauer der vaskulären Leckage kann je nach der Durchlässigkeit-induzierende Agent verwendet, und daher die Zeit zwischen intradermale Injektion und Keulung ggf. Optimierung.</li>
	<li>Jeder Ort gekeult Maus auf seinen Rücken und Pin seine Füße auf einer Pinnwand mit einem sauberen Tuch (Abbildung 1) gewickelt.</li>
	<li>Mit einer stumpfen Schere, machen Sie einen vertikalen Schnitt von ca. 3-4 cm vom unteren Bauch bis an die Brust der Toten Maus. Necken Sie mit Pinzette und Skalpell entfernt die Haut von beiden Flanken, die innere Seite der Dermis und Standorte der Evans blau Akkumulation (Abbildung 1E) zu offenbaren. Festzunageln Sie, die lose Haut und entfernen Sie Fett aus den Regionen rund um die Leckage-Website mit einem Skalpell zu. Falls erforderlich, nehmen Sie ein repräsentatives Foto zeigen das Ausmaß der Evans blau Leckage in die Haut.</li>
	<li>Mit Pinzette und Skalpell, Verbrauchsteuern hautregionen bestehend aus der durchgesickerten Evans blauen Farbstoff für jeden Standort mit der Durchlässigkeit-induzierende Agent oder Fahrzeug injiziert. Hinweis: Achten Sie darauf, die Verbrauchssteuer ähnlich großen Regionen der Haut um sicherzustellen, dass der nachfolgende Schritt 4.7 ein ähnlicher Teil der Formamid durch jede Hautprobe, so dass die extrahierten Farbstoff in einem ähnlichen Volumen des restlichen Formamid verdünnt werden adsorbiert werden wird . Die Injektion-Karte aufgezeichnet im Schritt 3.5 hilft definieren den Bereich herausgeschnitten werden.</li>
	<li>Legen Sie jede Probe in ein 1,5 mL Röhrchen und es entsprechend gekennzeichnet, sicherstellen, dass jede Probe ruht auf den Boden des Röhrchens. Speichern Sie die Proben bei - 20 ° C bis zur weiteren Verwendung. Wenn sofort verarbeiten, folgen Sie den Schritten unten.</li>
	<li>Trocknen Sie die Hautproben über Nacht, indem offene Rohre in einem Ofen oder in den Brunnen der Heizblock bei 55 ° C.</li>
	<li>Evans blauen Farbstoff zu extrahieren, die Proben in einer Dampfhaube 250 µL deionisiertes Formamid hinzugefügt werden, schließen Sie die Rohre. Stellen Sie sicher die Hautproben unterliegen alle der Formamid und inkubieren Sie über Nacht in einem Ofen oder einem Heizblock bei 55 ° C.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben in einer Benchtop-Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (> 10.000 x g) 40 min.</li>
	<li>Übertragen Sie in einer Dampfhaube 100 µL des Überstands Farbstoff-haltigen von jeder Probe in einen separaten Brunnen eine transparente, flacher Boden-96-Well-Platte (Abbildung 2A).</li>
	<li>Maßnahme Peak Evans blau Extinktion bei 620 nm mit einer Referenz-Lesung von 740 nm auf einem Spektrophotometer. Hinweis: 620 nm ist der Höhepunkt von Evans blau Extinktion, während 740 nm wird nicht von Evans blau absorbiert und wirkt wie eine Referenzwellenlänge.</li>
	<li>Durchschnitt der Extinktion Lesungen von dreifacher Injektionen von den gleichen Agenten oder Fahrzeug für jede Maus, um technische Variabilität (Abb. 2 b) zu berücksichtigen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Falte Differenz Lesungen von Durchlässigkeit-induzierende Agent versus Fahrzeugkontrolle (Abbildung 2).</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen zu erklären.

Seit seiner Erstbeschreibung im Jahr 195217hat die Miles-Assay Forscher eine relativ schnelle, einfache und zuverlässige Methode zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der vaskulären Hyperpermeability gegeben. Zum Beispiel wurde die Miles-Assay zur testen die Fähigkeit und/oder Wirksamkeit von verschiedenen Agenten induzieren Hyperpermeability19,20,21 oder testen Sie die Wirksamkeit von Hyperpermeability blockierenden Agenten8 ,22,23. Ein weiteres Beispiel sind Agenten, die vaskuläre Permeabilität führen in genetisch veränderten Mäusen und ihren stellt Steuerelemente zur Ermittlung der Anforderungen an spezifische Rezeptoren und Proteine für Liganden-induzierte Hyperpermeability transducing Signal getestet worden Antworten10,11,12,13,14,15,20,23. Mehrere modifizierte Versionen des Miles Assays haben seit verwendet worden, zum Beispiel in Bezug auf die Tracer verwendet. So wurde Evans Blue in einigen Studien mit Fluoreszenz-markierten Dextrans verschiedener Größen oder Mikrosphären11,13ersetzt.
Der Hauptvorteil des Miles Assays gegenüber anderen Assays für vaskuläre Hyperpermeability Mechanismen zu untersuchen ist, dass es vergleichsweise einfach durchzuführen und keine teure Ausrüstung erfordert. Darüber hinaus als in Vivo Technik, dieser Assay Modelle vaskulären Leckage im Rahmen von intakten Blutgefäßen assays im Gegensatz zur Messung von Leckagen durch in-vitro- wie z. B. Trans Flussmittel Assays oder Trans endotheliale elektrischen Widerstand (gut TEER) Assays, die ausschließlich, auf die endotheliale monomolekularen Film konzentrieren. Die alternative in-Vivo -Assays der vaskulären Hyperpermeability abweichen von Miles Assays mithilfe eine abweichende Lieferanschrift Route für den Hyperpermeability-induzierende Agenten oder durch die Analyse von vaskulären Leckage an verschiedenen Standorten, für die hier beschriebenen Beispiel durch systemische Lieferung eines Agenten über die Rute Vene, gefolgt von vaskulären Leckage Prüfung in die Lunge oder Luftröhre11,13,15. Eine Einschränkung des Miles Tests ist, dass die intradermale Injektion von bestimmten Agenten kann im Prinzip auch Einfluss auf Blutdruck und fließen neben endotheliale Barriere Störung und, deshalb, auf vaskulären Permeabilität auch indirekt. Trotzdem dieser Assay vor kurzem wurde gezeigt, dass vaskuläre Permeabilität durch induzierte Messen VEGF-A unabhängig von Auswirkungen auf die systemischen Blutdruck15. Eine weitere Einschränkung des Miles-Assays ist, dass vaskuläre Betten in verschiedenen Geweben unterschiedlich zu Durchlässigkeit fördernde Mittel und Ergebnisse, die mit einem Miles-Assay in der Haut können daher nicht repräsentativ sein, zum Beispiel reagieren können der Vorgänge in der Lunge oder Gehirn.
Alter und Gewicht des Tieres beeinflussen die Leckage in der Miles-Assay beobachtet. Um die Wirkung dieser Variablen zu minimieren, Forscher verwenden wurfgeschwistern oder ähnlich Größe und Alter Mäuse als Kontrollen. Maus-Mutanten für ein bestimmtes Gen von Interesse zu beurteilen, sollten Mäuse durch eine heterozygote versus heterozygot Zucht Strategie und Wildtyp wurfgeschwistern verwendet als Steuerelemente generiert werden. Darüber hinaus ist es ratsam schnell reversibel Gas Anästhetika, wie Isoflurane, Vasokonstriktion, die für einige betäubende Medikament verabreicht über parenterale Injektionen24,25beschrieben worden ist, zu vermeiden. Die Injektion von Evans blauen Farbstoff in die Maus seitlich Heck Vene ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll und kann großen Einfluss auf die Qualität des Experiments und Daten. So Forscher müssen bei der Durchführung von Tail Vene Spritzen zuständig sein und wird wahrscheinlich brauchen Vorkenntnisse oder Praxis vor Beginn der Meilen assay experimentieren. Alternativ können Forscher andere intravenöse Strecken liefern Evans blau, wie Retro-Orbital-Injektion, wenn sie Erfahrung mit ihm haben. Intradermale Injektion der Förderung der Durchlässigkeit Lösungen Agent-unabhängige Schäden an der Haut verursachen können. Daher sollte intradermale Injektionen sollte nicht mehr als 20 µl Volumen, immer im Beisein der Histamin-Inhibitor durchgeführt und auf Fahrzeug-Kontrolle-Injektionen normalisiert.
Meilen-Assay wurde von vielen Forschern verwendet, um Komponenten der VEGF-A Signalweg, z. B. zu bewerten weil VEGF-A-induzierten vaskulären Permeabilität Aszites bei Krebs Patienten16 und Vision beeinträchtigen Ödem in mehreren neovaskulären verursacht Auge Krankheit7. So haben wir und andere die Miles-Assay verwendet VEGF-A induzierten vaskulären Leckage bei Mäusen zu vergleichen, die gentechnisch verändert wurden, um bestimmte Komponenten des VEGF-A Signalisierung Kaskade12,13,14, fehlt 15 , 20 , 23. unsere aktuelle Studie, die mit dieser Methode ergab, dass die wichtigsten pathologische VEGF-A-Isoform, VEGF165, durch einen Komplex von VEGFR2 und NRP1 signalisiert, in denen die NRP1 cytoplasmatische Domäne die ABL-Kinase-vermittelte Aktivierung des SRC Familie Kinasen fördert eine Hyperpermeability Antwort14hervorrufen. VEGFA fördert Wachstum von Blutgefäßen und könnte daher therapeutisch zur Blutfluss zu ischämischen Gewebe wiederherzustellen, wenn seine Hyperpermeability Tätigkeit spezifisch gehemmt werden könnte verwendet werden. Aufklärung der molekularen Mechanismen, die VEGF-A Antworten von vaskulären Endothelzellen in Richtung vaskuläre Hyperpermeability steuert Forschung könnte daher Wege identifiziert werden, die gezielt manipuliert werden können, um pathologische VEGF-A induzierte Ödeme hemmen bei Krankheiten wie Krebs oder ischämischen Augenkrankheit. Meilen-Assay wird zweifellos weiterhin eine hilfreiche Methode, um untermauern diese und viele andere Arten von funktionellen Untersuchungen zur molekularen Regulatoren und Effektoren der vaskulären Hyperpermeability aufzuklären.

Die primäre Funktion des Herz-Kreislauf-Systems soll die Übertragung von Gasen, Nährstoffe und Abfallprodukte zwischen der Zirkulation und Gewebe in allen Organen zu ermöglichen. Blutgefäße haben organspezifischen basale Durchlässigkeit für solchen Austausch1zu ermöglichen. Zum Beispiel sind die Blutgefäße in der Niere hochpermeablen, während die Blut-Hirn-Schranke eine enge, sehr undurchdringliche Oberfläche2,3,4 bildet. Die Endothelzellen, die die innere Auskleidung der Blutgefäße bilden bieten eine physische Barriere zwischen dem Blutkreislauf und darunter liegende Gewebe und vaskulären Permeabilität in Organ-spezifische Weise zu regulieren. Jedoch führen bestimmte Reize eine partielle Aufschlüsselung der endotheliale Barriere um das Fluid Extravasation aus dem Kreislauf in das Interstitium über den basalen Ebenen1zu erhöhen. Solche Hyperpermeability ist zum Beispiel beobachtet, an Standorten von Gewebetrauma, bei Entzündungen, Tumoren, bei Sepsis, in Augen mit neovaskulären Krankheit oder im Gehirn und im Herzen, tritt Gewebe Ischämie durch einen Schlaganfall oder einen Herzinfarkt, bzw. 5 , 6 , 7 , 8. wenn chronisch erhöht, Hyperpermeability führt zu Ödem, wodurch wiederum Gewebeschäden, z. B. Verlust der Sehkraft im Auge Krankheit9. Modellierung der vaskulären Hyperpermeability Antwort ist also wünschenswert für das Verständnis der Mechanismen, die endotheliale Durchlässigkeit zu erhöhen und die Wirksamkeit der Wirkstoffe entwickelt, um dies zu hemmen zu testen.
Die Meilen-Assay ist eine gut etablierte, häufig verwendete und relativ einfache Technik, die vaskuläre Leckage in Vivo als Surrogat Maß für vaskuläre Hyperpermeability misst. Obwohl es nicht berücksichtigen ist Compoundierung Faktoren, die vaskuläre Leckage unabhängig von endotheliale Barriere Verordnung, wie Blutdruck oder Durchblutung, erhöhen können die Miles-Assay wird allgemein angenommen, ermöglichen eine zuverlässige Methode zur Bewertung der Durchlässigkeit-Modulation der Aktivität der Substanzen und identifizieren die Signalisierung Vermittler, die ihre Tätigkeit zu fördern. Dementsprechend die Miles-Assay wurde integraler Bestandteil zahlreicher Studien, die Mediatoren der vaskulären Hyperpermeability und ihre Mechanismen der Aktion10,11,12,13, identifiziert haben 14,15, z. B. den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor VEGF-A, wurde ursprünglich als der vaskulären Permeabilität Faktor VPF16identifiziert.
Ursprünglich entwickelt von Meilen und Meilen, vaskulären Permeabilität in Meerschweinchen17zu studieren, war ihre Assay nachträglich angepasst, mit Mäusen, die jetzt den Modellorganismus der Wahl, um die molekulare Mechanismen der vaskulären Permeabilität zu erhellen Verordnung aufgrund ihrer exquisiten Eignung zur Genmanipulation. Kurz, ist Evans blauen Farbstoff intravenös in Erwachsenen Mäusen injiziert und durfte für 30 Minuten (Abbildung 1) zirkulieren. Permeabilität-induzierende Wirkstoffe gegen Fahrzeugkontrolle werden dann mikrodialysemembranen an mehreren Standorten an gegenüberliegenden Flanken der Maus induzieren vaskulären Leck (Abbildung 1) injiziert. Folglich, gebundenen Sie Albumin-Evans blauer Farbstoff extravasates und reichert sich in der Dermis (Abbildung 1). Nach menschlich Keulung der Maus, ist Evans blau aus der Dermis und die Höhe der vaskulären Leck berechnet als Verhältnis der Test Substanz -, Fahrzeug-induzierte optische Dichte (Abbildung 2).

<table><tbody><tr><td>Pyrilamine maleate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>Resuspend in PBS</td></tr><tr><td>Deionised Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Microlance Needles 30g x 0.5&quot;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Plastipak 1ml Luer</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hair clippers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Scalpal&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td><td>Reliatech</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

Die primäre Funktion des Gefäßendothels in vertebrate Organismen ist, dienen als eine Barriere zwischen Blut und jedes Gewebe des Körpers, wobei die Permeabilität des Endothels, Blutzellen und Plasma Makromoleküle Wasser entsprechend angepasst werden kann die physiologische Notwendigkeit. Bei bestimmten Krankheiten werden Zytokine und Wachstumsfaktoren freigesetzt, die auf die endotheliale Barriere um vaskulären Permeabilität vorübergehend zu erhöhen; jedoch kann ihre verlängerte Anwesenheit chronische vaskuläre Hyperpermeability und damit Gewebe beschädigen Ödeme verursachen. Meilen-Assay ist eine in Vivo -Technik, die Forscher, vaskuläre Hyperpermeability durch die Proxy-Messung der vaskulären Leckage zu studieren können. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Durchführen dieses Verfahrens in der Maus ist die am weitesten verbreitete Modellorganismus Säugetier-Physiologie und Pathologie zu studieren. Das Verfahren beinhaltet die intravenöse Injektion von Evans blau färben, die zirkulierenden Albumin, gefolgt von mehreren intradermale Injektionen von Durchlässigkeit-induzierende Wirkstoffe und Fahrzeug-Control-Lösungen in gegnerischen Flanken der Maus zu kennzeichnen. Infolgedessen Lecks Evans blauen Farbstoff allmählich in die Dermis, wo es sammelt und zur Quantifizierung als Leckage induziert durch die Durchlässigkeit-induzierende Agent bezogen auf das Fahrzeug extrahiert werden kann. Meilen-Assay in Wildtyp durchgeführt werden kann oder genetisch veränderte Mausmodelle und sind kombinierbar mit Medikamentengabe Molekulare Mechanismen zu untersuchen, die vaskuläre Permeabilität zu regulieren und Agenten/Ziele in der Lage, Induktion oder Sperrung zu identifizieren Hyperpermeability.

Wir verwendet den Miles-Test zur Beurteilung der Fähigkeit von VEGF-A, vaskuläre Leck relativ Fahrzeugkontrolle (PBS) in Wildtyp C57/Bl6 Mäusen zu induzieren. Hier zeigen wir eine repräsentative Experiment mit Wildtyp-Mäusen angeregt mit intradermale Injektion von 20 µL Lösung mit 50 ng von VEGF-A in PBS oder Fahrzeug PBS nur. Eine deutliche Zunahme der Evans blauen Farbstoff Undichtigkeit Hautproben injiziert mit VEGF-A im Vergleich zu PBS war offensichtlich in Situ (Abbildung 1E) und nach der Extraktion des Farbstoffes in Formamid (Abbildung 2A). Quantifizierung von mehreren Experimenten zeigt, dass 50 ng von VEGF-A induziert signifikant mehr Evans blau Leckage als PBS allein (Abb. 2 b), mit einer durchschnittlichen Zunahme 3-fach vaskulären Leckage im Vergleich zum Fahrzeug (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Abbildung 1: Induktion von vaskulären Leckage in der Miles-Assay. Schematische Darstellung (Paneele) und entsprechende Bilder (untere Verkleidungen) der sequentielle Schritte bei der Durchführung des Miles-Tests in der Maus. (A) Pyrilamine Maleat ist intraperitoneal zur Vermeidung der Freisetzung von endogenen Histamin 10 bis 30 Minuten vor der (B) intravenöse Injektion von 100 µl 1 % Evans blau in das Heck der Maus Vene injiziert. (C) 30 min später, vaskuläre Leckage wird induziert durch intradermale Injektion des Agenten (50 ng von VEGF-A; grüne Kreise) versus Fahrzeugkontrolle (PBS, weiße Kreise). (D, E) Die Maus ist für den Zugriff auf Websites der Evans blau Akkumulation gekeult 20 Minuten nach der intradermale Injektion und die Haut von beiden Flanken seziert und festgenagelt. i.p.: intraperitoneale; i.v.: intravenös; i.d.: intrakutane; Skalieren Sie Bars, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Abbildung 2: Quantifizierung der vaskulären Leckage in der Miles-Assay. (A) Evans, den blauer Farbstoff in Formamid aus Hautproben jeder intradermale Injektion in Abbildung 1 entnommen und in eine 96-Well-Platte für Absorption mit einem Spektrophotometer lesen geladen extrahiert wird. (B, C) Grafische Darstellung der Extinktion Lesungen aus mehreren Experimenten durch Plotten entweder (B) die normalisierten Absorption Werte (optische Dichte, OD) der beiden Durchlässigkeit-induzierende Agent (VEGF-A; dunkle grüne Kreise) und Fahrzeug (PBS, grau (Kreise), oder (C) die Falte in OD für den Agenten gegen Fahrzeug verändern (Fehlerindikatoren: SEM). Die Extinktion Lesungen der dreifacher PBS und VEGF-A-Proben in (A) gezeigt werden gemittelt und in (B, C) als weiße oder grüne Kreise, bzw. angezeigt. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die vaskuläre Leckage induziert durch intradermale Verabreichung von Durchlässigkeit fördern Wirkstoffen in der murinen Haut zu messen. Diese Technik kann verwendet werden, um festzustellen, die Fähigkeit von Molekülen zu fördern bzw. hemmen vaskulären Leckage oder die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die vaskuläre Permeabilität zu regulieren.

Bewertung von vaskulären Hyperpermeability-induzierende Wirkstoffe in der Haut mit dem Meilen-Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Aufrufe.  University College London. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die vaskuläre Leckage induziert durch intradermale Verabreichung von Durchlässigkeit fördern Wirkstoffen in der murinen Haut zu messen. Diese Technik kann verwendet werden, um festzustellen, die Fähigkeit von Molekülen zu fördern bzw. hemmen vaskulären Leckage oder die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die vaskuläre Permeabilität zu regulieren.

Serie: Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary sites. Recently, we established that cancer cell dissemination in primary breast cancer and at metastatic sites in the lung occurs only at doorways called Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM). TMEM doorway number is prognostic for distant recurrence of metastatic disease in breast cancer patients. TMEM doorways are composed of a cancer cell which over-expresses the actin regulatory protein Mena in direct contact with a perivascular, proangiogenic macrophage which expresses high levels of TIE2 and VEGF, where both of these cells are tightly bound to a blood vessel endothelial cell. Cancer cells can intravasate through TMEM doorways due to transient vascular permeability orchestrated by the joint activity of the TMEM-associated macrophage and the TMEM-associated Mena-expressing cancer cell. In this manuscript, we describe two methods for assessment of TMEM-mediated transient vascular permeability: intravital imaging and fixed tissue immunofluorescence. Although both methods have their advantages and disadvantages, combining the two may provide the most complete analyses of TMEM-mediated vascular permeability as well as microenvironmental prerequisites for TMEM function. Since the metastatic process in breast cancer, and possibly other types of cancer, involves cancer cell dissemination via TMEM doorways, it is essential to employ well established methods for the analysis of the TMEM doorway activity. The two methods described here provide a comprehensive approach to the analysis of TMEM doorway activity, either in na&#239;ve or pharmacologically treated animals, which is of paramount importance for pre-clinical trials of agents that prevent cancer cell dissemination via TMEM.

We describe two methods for assessing transient vascular permeability associated with tumor microenvironment of metastasis (TMEM) doorway function and cancer cell intravasation using intravenous injection of high-molecular weight (155 kDa) dextran in mice. The methods include intravital imaging in live animals and fixed tissue analysis using immunofluorescence.

Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Forschung

Krebsforschung

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Medizin

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Biotechnik

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Immunologie und Infektion

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolierung und Verwendung von Rinder Abschnitte A. und V. mesenterica als Bioassay für Vasoaktivität im Dünndarm Testen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

Einen methodischen Ansatz, um Nicht-invasive Assessments der Gefäßfunktion und Morphologie

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Biologie

Erforschung neuer Mechanismen mikrovaskulärer Dysfunktion beim Menschen

Intradermal Microdialysis: An Approach to Investigating Novel Mechanisms of Microvascular Dysfunction in Humans

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate mechanisms of vascular smooth muscle and endothelial function in the cutaneous circulation. This technique allows for the pharmacological dissection of the pathophysiology of microvascular endothelial dysfunction as indexed by decreased nitric oxide-mediated vasodilation, an indicator of cardiovascular disease development risk. In this technique, a microdialysis probe is placed in the dermal layer of the skin, and a local heating unit with a laser Doppler flowmetry probe is placed over the probe to measure the red blood cell flux. The local skin temperature is clamped or stimulated with direct heat application, and pharmacological agents are perfused through the probe to stimulate or inhibit intracellular signaling pathways in order to induce vasodilation or vasoconstriction or to interrogate mechanisms of interest (co-factors, antioxidants, etc.). The cutaneous vascular conductance is quantified, and mechanisms of endothelial dysfunction in disease states can be delineated.

Autor im Rampenlicht: Ein Pharmakodissektionsansatz zur Aufdeckung von Mechanismen in Risikopopulationen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen 

Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate microvascular function in health and disease. Both dose-response and local heating protocols can be utilized for this technique to explore mechanisms of vasodilation and vasoconstriction in the cutaneous circulation.

Intradermale Mikrodialyse: Ein Ansatz zur Untersuchung neuer Mechanismen der mikrovaskulären Dysfunktion beim Menschen

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally ...

Bewertung von vaskulären Hyperpermeability-induzierende Wirkstoffe in der Haut mit dem Meilen-Assay

Zusammenfassung

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Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

Ein

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten

Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Isolierung und Verwendung von Rinder Abschnitte A. und V. mesenterica als Bioassay für Vasoaktivität im Dünndarm Testen

Einen methodischen Ansatz, um Nicht-invasive Assessments der Gefäßfunktion und Morphologie

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Intradermale Mikrodialyse: Ein Ansatz zur Untersuchung neuer Mechanismen der mikrovaskulären Dysfunktion beim Menschen

Intradermale Mikrodialyse: Ein Ansatz zur Untersuchung neuer Mechanismen der mikrovaskulären Dysfunktion beim Menschen

Intradermale Mikrodialyse: Ein Ansatz zur Untersuchung neuer Mechanismen der mikrovaskulären Dysfunktion beim Menschen