Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Institute der Gesundheit Tier Verwendung Richtlinien durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01NS093073 und R21AA024873), C. Gu unterstützt.

Alle nachfolgend beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der Ohio State University genehmigt.
(1) Deckglas Vorbereitung
<ol><li>Legen Sie einen oder mehrere Kisten mit 12 mm oder 25 mm Deckgläsern in ein Becherglas mit 70 % Salpetersäure und inkubieren Sie Deckgläsern bei Raumtemperatur über Nacht. Hinweis: Waschen Sie die 25 mm Deckgläsern im gleichen Becher als 12 mm Deckgläsern nicht. Es ist besser, sie separat zu waschen.</li>
	<li>Übertragen Sie alle Deckgläsern in 4 L Becher gefüllt mit 2,5 L DdH2O und schütteln Sie den Becher mit den Deckgläsern für 1 h bei 100 u/min. Verwenden Sie Gummibänder die Becher beim Schütteln zu halten. Wiederholen Sie das Spülen mit frischen 2,5 L DdH2O viermal.</li>
	<li>Übertragen Sie gereinigte Deckgläsern auf eine trockene Flasche mit einem Metalldeckel. Backen Sie die Deckgläsern in einem Ofen bei 225 ° C für 6 h und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Hinweis: Die 25 mm-Deckglas ist anfällig für Bruch. Deckgläsern eins nach dem anderen zu trennen und an der Luft trocknen, dann in einem Ofen zu backen.</li>
	<li>Lagern Sie die getrocknete und gereinigten Deckgläsern bei Raumtemperatur bis zur Verwendung in einem sterilisierten Plastikbehälter.</li>
	<li>
Bestreichen Sie die Deckgläsern wie folgt:
	<ol>
<li>Bereiten Sie frische Beschichtungslösung in ein Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Platzieren Sie jedes Deckglas in einem Brunnen einer 24-Well (oder 6-Well) Platte. Platz 30 (oder 100) µL des Deckglases Beschichtungslösung (Tabelle 1) auf eine 12 mm (oder 25 mm) Deckglas und Wirbel. Fügen Sie 1 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, Gewebekultur Grade) zum Brunnen. Diese Platten können sofort verwendet oder bei 4 ° C in sterilen PBS für bis zu einer Woche gelagert werden.</li>
		<li>Am Tag der Dissektion entfernen Sie die PBS. An der Luft trocknen Sie und legen Sie die Platten unter UV-Licht (30W) für 2-4 h. Hinweis: Der letzte Schritt sollte mit UV-Licht auf in eine Zelle Kultur Laminar-Flow Haube abgeschlossen sein. Die Tür der Haube sollte leicht angehoben werden, um Luftstrom zu ermöglichen, für die Trocknung der Deckgläsern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Präparation, Dissoziation und Kultur der Hippocampal Neuronen aus Schwangere Maus/Ratte
<ol><li>
Dissektion und Dissoziation des hippocampal Neuronen für Kultur
	<ol>
<li>Protease Enzymlösung (3 mg/mL Protease 23 in SLDS, Tabelle 1) Auftauen und Vorwärmen Beschichtung Medien (Tabelle 2) bei 37 ° C.</li>
		<li>Hippocampus zu sezieren und Spülen mit SLDS, nach den Methoden, die in früheren Publikation14beschrieben. Hinweis: Vier hippokampi bieten genügend Zellen für einen 24-Brunnen oder eine 6-Well-Platte.</li>
		<li>Entfernen Sie SLDS zu, fügen Sie 2 mL Enzymlösung Protease und inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C, 5 % CO2 für 15 min.</li>
		<li>Waschen Sie der Hippocampus Explantaten mit 5-10 mL Beschichtung Medium zweimal. Hinzugeben Sie 5 mL Medium Plattieren. Hippocampale Explantaten in Einzelzellen zu distanzieren, erzeugen einen kleinen Wirbel mit einer Pipette mit einer 1-mL-Kunststoff-Spitze. Pipette rauf und runter ca. 40 Mal, vermeiden die Bildung von sauerstoffbläschen, bis die Lösung trüb wird und keine großen Stücke des modellabhängigen bleiben. Hinweis: Denken Sie daran, einige Medien während Waschungen zu verlassen, der Hippokampus Explantaten während des gesamten Prozesses in das Medium eingetaucht bleiben sollen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.125 x g für 3 min. Entfernen des Überstands mit den Zellen in den Medien überflutet. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 145 mL Plattieren Medien. Fügen Sie 1 mL/Well die Zellsuspension auf einer 24-Well-Platte (3 mL/Brunnen, ein 6-Well-Platte). Hinweis: 145 mL Plattieren Medien wird verwendet, um eine Zellsuspension zu produzieren, die eine niedrige Zelle Dichte aufweist. Dieser Band ermöglicht die Beschichtung von Zellen in sechs 24-Well-Platten, acht 6-Well-Platten oder verschiedene Kombinationen von 24 oder 6-Well Platten abhängig von den Experimenten durchgeführt werden. Jede Vertiefung des 24-Well-Platte wird etwa 3 x 104 Zellen9haben.</li>
		<li>Brüten Sie die Zellen in den Überzug Medien bei 37 ° C, 5 % CO2 für 2-4 h, dann entfernen Sie alle Beschichtung Medien und ersetzen Sie es mit frischen Wartung Medien.</li>
		<li>Nach 2 Tagen (2 Tage in Vitro, 2DIV), ersetzen Sie die Hälfte der Medien mit 2 µM Ara-C (Arabinosylcytosine) aufgelöst in Wartung Medien das Wachstum von Fibroblasten, Endothelzellen und Glia-Zellen hemmt. Ersetzen Sie nach der Freilegung Zellen, Ara-C für zwei Tage die Medien mit frischen Wartung Medien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfektion zur Visualisierung der Zellmorphologie Hinweis: Transfizieren Sie Zellen mit fluoreszierenden Konstrukte des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), mCherry, etc. , die Morphologie einzelner Neuronen zu beleuchten.<ol>
<li>Verdünnen Sie die Konstrukte ab Lager (1 µg/µL) in Opti-MEM Media (0,8 µg des Konstrukts in 50 µL der Opti-MEM Media) und Wirbel. 1 Konstrukt Verdünnung für jedes gut vorbereiten. Hinweis: Eine 24-Well-Platte erfordert 0,8 µg des Konstrukts in 50 µL der Opti-MEM-Medien. Eine 6-Well-Platte erfordert 2,4 µg des Konstrukts in 150 µL Opti-MEM-Medien.</li>
		<li>Verdünnen Sie Liposomen-vermittelte Transfektion Reagenz in Opti-MEM Media (1,5 µL des Transfection Reagens in 50 µL der Opti-MEM Media) und Wirbel. 1 Transfektion Verdünnung für jedes gut vorbereiten. Hinweis: Eine 24-Well-Platte erfordert 1,5 µL Transfection Reagens in 50 µL der Opti-MEM-Medien. Eine 6-Well-Platte erfordert 4,5 µL Transfection Reagens in 150 µL des Opti-MEM Media.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1:1 Mischung (100 µL) des Konstrukts im Opti-Mem Media und Transfection Reagens in Opti-MEM Media und Wirbel. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min. Hinweis: Pro Bohrloch sollte etwa 100 µL Lösung mit Konstrukt, Transfection Reagens und Opti-MEM Media, wenn mit einer 24-Well-Platte (300 µL für 6-Well-Platte).</li>
		<li>Die Hälfte der Medien (500 µL für 24-Well-Platte, 1,5 mL für 6-Well-Platte) aus jedem Brunnen zu entfernen und dieses Medium in einer sauberen konischem Rohr übertragen. Halten Sie diese Röhre im Inkubator. Fügen Sie 100 µL Gemisch (Schritt 2.2.3) die restlichen Medien in den Brunnen. Lassen Sie die Zellen, die bei 37 ° C für 20-30 min inkubieren.</li>
		<li>Während der Inkubation (Schritt 2.2.4) fügen Sie 1 Volumenteil frische Wartung Medien Medien in das konische Rohr (Schritt 2.2.4 hinzu). Legen Sie die Mischung in den selben Inkubator (37 ° C und 5 % CO2).</li>
		<li>Entfernen Sie nach der Inkubation alle Medien, die die Transfektion Lösung aus dem Brunnen zu und ersetzen Sie es mit dem 1:1 Mischung aus alten und frischen Wartung Medien in das konische Rohr (Schritt 2.2.5). Hinweis: Abhängig von der Größe der Konstrukte können Zellen beginnen mit dem Ausdruck innerhalb von 12 h; für größere Konstrukte können 3-4 Tage erforderlich sein, bevor der Gipfel Ausdruck der Konstrukte erreicht wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Einrichten der Puffing Pipette Apparat
Hinweis: Es gibt fünf grundlegende Komponenten zu diesem Set-up: die Glaspipette, das Rohr der Spritze, der Mikromanipulator und Puffer (Hank). Puffer, die physiologisch relevante Salzkonzentrationen hat könnte in diesem Set-up verwendet werden.
<ol><li>Ziehen Sie eine Borosilikat-Pipette, um 45 µm Durchmesser Öffnung Spitze mit einer Mikropipette Puller und die Angaben in Tabelle 3zu haben. Hinweis: Es wurde festgestellt, dass 45 µm ist eine geeignete Größe für den Durchmesser der Öffnung unter experimentellen Bedingungen Pipette. Geringfügige Abweichungen in der Größe der Öffnung sollte Ergebnisse nicht wesentlich beeinflussen. Es ist wichtig zu beachten, dass größere Abweichungen von dieser Nummer noch arbeiten sollten für Varizen Induktion durch die Höhenverstellung der Spritze, die mit der Pipette über Schläuche verbunden ist, aber dies erfordert eine Rekalibrierung der Druckwert.</li>
	<li>Legen Sie die UN zog Ende der Pipette in dünnen Gummischlauch. Hinweis: Die Schlauch Wand sollte dünn und starre, Flüssigkeitsbeständigkeit, um sicherzustellen, dass die Höhe der Spritze ist direkt proportional zum Druck der Flüssigkeit fließt durch die Pipette mit vernachlässigbaren Widerstand zu minimieren. Der Schlauch sollte nicht mehr als etwa 0,6 m Länge weiter minimieren den Widerstand.</li>
	<li>Verbinden Sie das andere Ende des Schlauches auf einen 10-mL-kunststoffspritze über einen Connector mit einem Zug-Lage Ventil. Hinweis: Die kunststoffspritze muss bei einer Konstanten, messbare Höhe um ein genaues Maß für den angenommenen Druck fließt aus der Pipette zu gewährleisten. Eine Höhe von 190 mm wurde verwendet, da diese sorgt für minimalen Druck sondern zuverlässig Krampfadern in Axone induziert. Anderen Höhenwerte können auch verwendet werden, wenn der Druck dazu führen, die Zellen dass, von dem Deckglas Oberfläche zu lösen. Es wird empfohlen, die gleiche Einstellung während des Experiments zu verwenden.</li>
	<li>Legen Sie die Pipette in Schraube oben Mikromanipulator auf die Pipette in Position zu halten. Die Schraube aus Metall, flache gekrönt mit dem Mikromanipulator Arm befestigt, so dass es hält das UN-zog Ende der Pipette oberhalb wo der Gummischlauch befestigt ist. Winkel der Pipette in einem 45°-Winkel mit der Oberfläche der Neuron-haltigen Deckgläsern. Hinweis: Der Mikromanipulator sollte gebaut werden, so dass die Pipette stattfinden kann, ohne Verengung der Gummischlauch. Der Mikromanipulator darf Bewegung der Pipette in der x-, y- und Z-Richtung, genau innerhalb der Zellbereich zu positionieren. Eine Grafik sowie ein Foto des Geräts erfolgt unter (Abbildung 1).</li>
	<li>Schalten Sie ein Fluoreszenz-Filter, öffnen Sie die Blende und sicherzustellen Sie, dass eine fluoreszierende Stelle kommt durch das Ziel gesehen werden kann. Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in eine Position, die reiht sich die Spitze mit dem fluoreszierenden Punkt und senken Sie die Pipette in eine Position direkt über die Höhe der Zelle Kulturschale (35 mm x 10 mm). Sobald sie in der Lage ist, das transmittierte Licht schalten Sie ein und schalten Sie Fluoreszenz aus.</li>
	<li>Mit einer Pinzette, einem Deckglas (mit den Zellen nach oben in Richtung der Pipette) aus hinzufügen der Zellplatte Kultur der Zelle Kulturschale mit etwa 2 mL Hanks Puffer bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Ort der Kulturschale mit dem Deckglas auf den Anwendungsbereich.</li>
	<li>Mit den feinen fokussierknopf und 20 X Objektiv, konzentrieren Sie sich auf einer Ebene über vier volle Umdrehungen über die Zellen (ca. 0,4 mm). Verwenden Sie der Mikromanipulator, um die PIPETTENSPITZE zu positionieren, so dass es konzentriert und in der Mitte, Links von der Ebene gesehen durch die Okulare. Hinweis: Dendriten sind Projektionen, die im gleichen Rahmen wie die Zellkörper sein sollten, die, denen Sie stammen. Axonale Krampfadern zu induzieren, sollte man längere Projektionen vom Zellkörper, medialen und distalen Axone folgen.</li>
</ol>4. Kalibrierung des Drucks der Pipette eine dehnbare Membran-System nutzen
<ol><li>Richten Sie der puffing Pipette Apparat mit den exakten gleichen Parametern wie oben beschrieben über ein System mit einer Microfabricated-Silikon-Membran (500 µm im Durchmesser) und 50 µm dick ein und konzentrieren Sie das Mikroskop auf der Oberfläche der Membran zu. Hinweis: Dieses System wurde entwickelt, um kleine Druckwerte zu messen und eine Erklärung des Systems vor10veröffentlicht wurden. Diese Messung muss nur einmal durchgeführt werden, für Experimente schnaufend, wenn die exaktere gleiche Einstellung der schnaufend verwendet wird.</li>
	<li>Konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Arrays mikropunkte (4 µm im Durchmesser) und 10 µm auseinander, gemessen zwischen Zentren. Drehen Sie das Absperrventil und Flüssigkeiten Sie fließen aus der Pipette. Die Auslenkung der Membran als Reaktion auf den Flüssigkeitsdruck mit einem konfokalen Mikroskop zu untersuchen.</li>
	<li>Nutzen Sie ein lineares Modell um den entsprechenden Druck verbunden mit Auslenkung der Membran zu bestimmen. Hinweis: Während einer kürzlich durchgeführten Studie festgestellt, dass eine Durchbiegung w =-3.143 ± 0,69 µm wurde für Spritze Höhe 190 mm erhalten, dies führte zu einen Druck von 0,25 ± 0,06 nN/µm2 aus dem aktuellen Pipette Setup, die innerhalb der physiologischen und pathologischen, allerdings ist die Spritze-Höhe ist nicht der einzige bestimmende Faktor. Andere Faktoren beeinflussen die genaue Druckwert auf die Neuronen, einschließlich Pipette öffnen, Positionierung (Abstand und Winkel) der Pipettenspitze im Vergleich zu den Zellen und auch die Flexibilität der Schlauch4,10.</li>
</ol>5. schnaufend um Krampfadern zu induzieren
<ol><li>Sobald die Pipette in Position ist, konzentrieren Sie sich das Mikroskop auf ein Flugzeug, das eine Zielregion enthält. Positionieren Sie die Zellen und Prozesse in der linken Hälfte des Bildfeld (gesehen von live Aufnahme der Kamera) im Bereich puffing, während die Rechte Hälfte ist außerhalb Bereich schnaufend. Hinweis: Aufgrund von umfangreichen Auswuchs der Axone und Dendriten der Nervenzellen ist es unwahrscheinlich, dass alle Prozesse eines Neurons im gleichen Bereich und puffing sind. Dies ist tatsächlich ein Vorteil von diesem System, das ermöglicht die Prüfung der die lokale Wirkung der schnaufend. Es gibt zwei Arten von schnaufend, die genutzt werden können, um Krampfadern zu induzieren: lange Dauer schnaufend und Puls schnaufend.</li>
	<li>
Schnaufend
	<ol>
<li>Langer Dauer schnaufend<ol>
<li>Positionieren Sie die Spritze in die Höhe 190 mm über das Deckglas mit kultivierten Neuronen4. Beginnen Sie Time-Lapse Imaging Bereich von Interesse mit einer optimierten Belichtungszeit offenbart klare neuronale Morphologie. Erfassen Sie mindestens 15 Frames in einem 2 s-Intervall (30 s gesamt) als Grundlage. Das Intervall kann anhand des Experiments angepasst werden. Bei Frame 16, öffnen Sie wiederum in der Lage Absperrventil der Spritze und lassen Flüssigkeit für 75 Frames (150 s). Drehen Sie bei Frame 75 das Ventil aus, so dass Flüssigkeit fließen Haltestellen. Videoaufnahme zu stoppen. Hinweis: Dies sollte axonalen Krampfadern in Neuronen 7-9 DIV innerhalb von 5-10 s, induzieren während ältere Neuronen Form Krampfadern länger dauern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Schnaufend Puls (2 s Dauer)<ol>
<li>Positionieren Sie die Spritze in der richtigen Höhe (190 mm). Time-Lapse Bildgebung beginnen und mindestens 15 Frames zu erfassen (30 s) in einem 2 s-Intervall. Öffnen Sie bei Frame 16 das Ventil der Spritze Flüssigkeit fließen lassen und schließen Sie das Ventil nach 2 S. warten 5-20 s (abhängig von der Frequenz zu prüfenden) vor dem Öffnen des Ventils wieder. Wiederholen Sie öffnen und Schließen des Ventils Fluid Impulse zu schaffen, und fahren Sie für einen Gesamtzeitraum von 150-300 s. weiter Zeitraffer imaging für 20 min, die Erholungsphase zu erfassen. Hinweis: Wenn das Intervall ist länger als 10 s, die Impulse induzieren drastisch weniger Krampfadern. In einem 20 s-Intervall können keine Krampfadern durch die Impulse-4induziert werden. Um zuverlässige, konsistente Varizen-Bildung zu erhalten, ist es ratsam, die Spritze Höhe sollte ca. 190 mm. Spritze Höhe und Flüssigkeitsdruck sollte nicht erhöht werden, bis zu einem Punkt, wo Zellen beginnen von der Oberfläche Deckglas abnehmen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vor einem Tag voller Einsatz, reinigen die Set-up (Pipette, Schlauch und Spritze) fließt über 10 mL 70 % Ethanol durch das Set-up. Im Anschluss an das Ethanol waschen, 10 mL Hanks Puffer (oder gewünschten Puffer) durch die Einrichtung des Systems für den Einsatz des Tages Prime fließen. Nach der Veredelung Experimente für den Tag, reinigen Sie das Set-up als zuvor beschriebenen mit Ethanol zu verhindern das Wachstum von Schadstoffen über Nacht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) Ergänzend zu Methoden
Hinweis: Die puffing Assay kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Techniken kombiniert werden, die im Abschnitt Einführung diskutiert werden. Hier ist der Fokus auf den Kern-Techniken, die am häufigsten zusammen mit der puffing Assay, einschließlich hochauflösender Fluoreszenz Timelapse Bildgebung, Kalzium Imaging und Wiederherstellung Assays verwendet werden. Diese werden nachfolgend erläutert.
<ol><li>
Durchführen Sie hochauflösende fluoreszierende Zeitraffer Bildgebung durch nach dem Protokoll unten
	<ol>
<li>Verfolgen Sie die Bewegung der eindringmittel getaggt Proteine innerhalb der Neuronen mit 100 X Öl-Objektiv. Neuronen sind mit dem richtigen cDNA-Konstrukt transfiziert. Für 150 Frames erfassen (Gesamt 300 s) mit einem 2 s-Intervall. Hinweis: Manchmal wird Multiple-Farbe Zeitraffer Bildgebung durchgeführt, um die Bewegung von mehr als einem eindringmittel getaggt Protein gleichzeitig Bild.</li>
		<li>Generieren Sie eine Glomeruli durch die Video-Aufnahme-Software oder durch ImageJ (NIH). Hinweis: Die Geschwindigkeit und die Richtwirkung des Reisens können bestimmt werden mit Hilfe der Glomeruli. * Sicher festzustellen, die Richtung die Soma aus der Region liegt erfasst. Reisen in Richtung der Soma ist rückläufig, während Reisen abseits der Soma in der axonalen Spitze Anterograde.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Prozess nach puffing, oder ein Glomeruli mit der Bilderfassung während des puffing Tests erstellt werden kann. Hinweis: Die Auswirkungen der schnaufend auf axonalen Transport von Mitochondrien und synaptischen Proteine wurden in einem aktuellen Papier4gezeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcium imaging
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 µL (für ein 24-Well-Platte) oder 3 µL (für eine 6-Well-Platte) von 5 mM Fluo-4 Uhr zur Kultur Medien in einem gut und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL Hank Puffer. Hinweis: Geladene Neuronen emittieren grün fluoreszieren durch einen FITC-Filter-Set. Loci bezeichnen Regionen spürbar Kalzium in der Zelle. In Kombination mit schnaufend kann eine Zunahme der Intensität (Anstieg der internen Kalziumspiegel) gesehen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Varizen-Erholung Hinweis: Unmittelbar nach einem puffing Experiment kann eine 20 min Erholung Experiment durchgeführt werden.<ol>
<li>Aufnahmen für 300 Frames (1.200 s) mit einem 4 s-Intervall. Hinweis: Eine Zelle mit löslichen YFP/mCherry/GFP transfiziert sollte zeigen mäßigen Lautstärke (weniger als 50 %) der Erholung bis zum Jahresende die imaging-Sitzung. Axonalen Erholung hängt von einer Reihe von Faktoren, wie z. B. vom Entwicklungsstadium der kultivierten Neuronen4. Dies kann auch mit hochauflösenden Fluoreszenz-Bildgebung und Kalzium Imaging oben beschriebenen kombiniert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Verfahren des Microbiomechanical Assays ist geradlinig. Es werden zuverlässige Ergebnisse produzieren, wenn alle seine Schritte sorgfältig durchgeführt werden. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die, wenn nicht ordnungsgemäß durchgeführt, erfolgreiche Datenerfassung behindern. Die entscheidenden Schritte beginnen oberhalb der tatsächlichen Anwendung des puffing Stimulus. Sorgfältige Dissektion, Kultivierung und Pflege der primäre Neuron Kultur im Vordergrund stehen. Wenn die kultivierten Neuronen nicht gesun...

Varizen-Bildung oder Schwellung/Sicke, entlang der Axone, ist ein hervorstechendes Merkmal der Neurodegeneration bei vielen Erkrankungen oder Verletzungen des zentralen Nervensystems, einschließlich multipler Sklerose, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, beobachtet und traumatischen Gehirn Verletzungen1,2. Trotz der erheblichen physiologischen Auswirkungen der axonalen Krampfadern auf Aktionspotential Ausbreitung und die synaptische Übertragung3wie die Krampfadern entstehen, bleibt unbekannt. Vor kurzem, mit einer neu gegründeten Microbiomechanical-Assay auf kultivierten hippocampal Neuronen von Nagetieren, fanden wir, dass mechanische Reize Krampfadern in diesen Neuronen mit höchst faszinierende Funktionen hervorrufen können. Erstens Varizen Induktion ist schnell (< 10 s) und dieser Prozess kann unerwartet rückgängig gemacht werden. Zweitens, Varizen Einleitung hängt von der Stärke schnaufend Druck: je höher der Druck, desto schneller die Einleitung. Varizen Einleitung hängt Drittens neuronalen Alter. Die Axone der jüngere Neuronen scheinen stärker auf die mechanische Beanspruchung im Vergleich zu älteren Neuronen. Vierter, Krampfadern Form entlang der Axone hippocampal Neuronen, während die Dendriten und erste Axon Segmente dieser Neuronen zeigen keine Veränderung unter den gleichen Bedingungen, puffing. So, unsere Studie ergab ein Novum der neuronale Polarität. Diese Erkenntnisse mit dem in-vitro- System sind physiologisch relevanten. Eine in Vivo Modell zeigten für milde traumatische Hirnverletzungen (mTBI) wir, dass axonale Krampfadern in einer Multi-focal Mode im somatosensorischen Cortex der Mäuse, sofort nach dem Schließen-Totenkopf Aufprall, Einklang mit unserem in-vitro entwickelt- Ergebnisse4. Es ist wichtig zu beachten, dass unsere Färbung und Bildgebung der mTBI Mäuse nur eine Momentaufnahme der neuronalen morphologische Veränderungen, seit Durchführung in Vivo Zeitraffer Bildgebung der neuronale Morphologie während eine mechanische Wirkung ist noch nicht möglich.
Diese Flüssigkeit schnaufend System erlaubt uns nicht nur einzigartige Eigenschaften zu mechanischen Stress-induzierte Varizen-Bildung zu erfassen, sondern auch den zugrunde liegende Mechanismus zu bestimmen. Durch das Testen verschiedener extrazellulären Lösungen, Blocker und Öffner der verschiedenen Kandidaten der Mechanosensitive Ionenkanäle und zelluläre Elektrophysiologie, festgestellt wir, dass die Transienten Rezeptor potenzielle kation Kanal Unterfamilie V Bauteil 4 (TRPV4) Kanal, der ist durchlässig für Ca2 + und Na+ und aktiviert durch schnaufend ist hauptverantwortlich für die erste mechanischen Beanspruchung während der axonalen Varizen Bildung4erkennen. Dies wurde noch mit einem SiRNA ko Ansatz bestätigt. Zusammengenommen, diesem neuen Testsystem, die wir mit hippocampal Neuronen Kultur entwickelt haben, ist sehr wertvoll für die Mikromechanische Eigenschaften des zentralen Neuronen, vor allem in Kombination mit anderen Techniken zu studieren.
Dieses mikromechanische System, die, das wir eingerichtet haben, ist einzigartig und unterscheidet sich von den bereits bestehenden Systemen in einigen wichtigen Aspekten. Zuerst erleben die Neuronen in diesem System Out-of-Plane mechanischen Beanspruchung in den Formen der Kompression und Scheren. Während die mechanischen Auswirkungen neuronale Prozesse bleiben an der Oberfläche Deckglas und bewegen sich nicht. Dies unterscheidet sich von anderen experimentellen Systemen, die vor allem bücken und Strecken in der Ebene beteiligt (oder Spannung), zum Beispiel die Durchbiegung der gebündelte Axone wie Saiten5,6 verschieben oder dehnen Axone auf Micropatterned gewachsen Kanäle und dehnbare Membranen7,8. Darüber hinaus obwohl axonale Krampfadern auch in induziert werden können diese Tests wie in unserem Flüssigkeit schnaufend System, den Prozess in diesen Einstellungen dauert viel länger (ab 10 min bis mehreren Stunden6,7,8) und erscheint irreversible. Zu guter Letzt unser System mit lokalen Fluid schnaufend ermöglicht die Untersuchung der räumlichen Eigenschaften der Varizen-Bildung (zB., Dendriten, dendritische Dornen, Soma, axonalen ersten Segmente axonalen Klemmen), neben seiner zeitlichen Eigenschaften. Mit diesem System haben wir mehrere unerwartete und einzigartige Eigenschaften der axonalen Varizen-Bildung, vor allem schnellen Wirkungseintritt langsam Reversibilität und Axon-Dendrit Polarität entdeckt.
Das System, das wir in diesem Papier zu diskutieren ist kompatibel mit vielen Techniken der molekularen und Zellbiologie. Zum Beispiel zur Untersuchung der Auswirkungen von mechanischem Stress auf neuronale Morphologie und Funktion zusammen mit Myelin Coculture, Time-Lapse Bildgebung des Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) und Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) einsetzbar Calcium Imaging und Patch-Clamp-Aufnahme. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf den Kern-Komponenten des Systems. Hippocampal Neuronen Kultur, die Flüssigkeit schnaufend Setup, hochauflösender Zeitraffer Imaging für axonalen Transport und Kalzium Imaging werden Schritt für Schritt unten illustriert.

<table><tbody><tr><td>12 mm coverslips&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-0702</td><td>for 24-well plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25 mm coverslips&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-545-102&amp;nbsp;</td><td>for 6-well plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11 179 179 001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Protease enzyme&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x (P/S)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Earle&#039;s Salts&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosylcytosine (Ara-C)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM media&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>1854313</td><td>transfection reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate rods&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>for puffing pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>rubber tubing&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10cc plastic syringe and plunger</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F14201</td><td>for calcium imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mito-YFP construct&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>for cell transfection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1 construct&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>for cell transfection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Mcroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x lens&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 oil lens&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>objective&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a microbiomechanical system for studying varicosity formation and recovery in central neuron axons

Axonale Krampfadern sind erweiterte Strukturen entlang der Wellen von Axonen mit ein hohes Maß an Heterogenität. Sie sind nicht nur im Gehirn mit neurodegenerativen Erkrankungen oder Verletzungen, sondern auch im normalen Gehirn. Hier beschreiben wir eine neu gegründete mikromechanische System, schnell, zuverlässig und reversibel axonale Krampfadern, induzieren, ermöglicht es uns, die EZB, Varizen-Bildung und heterogenen Proteinzusammensetzung Mechanismen zu verstehen. Dieses System stellt eine neuartige Mittel zur Bewertung der Auswirkungen von Kompression und Shear Stress auf verschiedenen subzelluläre Kompartimente von Neuronen, anders als andere in-vitro- Systeme, die sich hauptsächlich auf die Wirkung von stretching. Vor allem aufgrund der einzigartigen Merkmale unseres Systems haben wir vor kurzem eine neuartige Entdeckung zeigt, dass die Anwendung der unter Druck stehende Flüssigkeit schnell und reversibel axonale Krampfadern durch die Aktivierung eines Transienten Rezeptor potenzielle Kanals hervorrufen kann. Unsere biomechanische System kann bequem in Kombination mit Medikamenten Perfusion, live Cell Imaging, Kalzium Bildgebung und Patch-Clamp-Aufnahme genutzt werden. Daher kann diese Methode für das Studium Mechanosensitive Ionenkanäle, axonalen Transport Verordnung axonalen Zytoskelett Dynamik, Kalzium-Signalisierung und morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit traumatischen Hirnverletzungen übernommen werden.

Vor schnaufend, zeigen Axone normalerweise kleine Varizen-Bildung. Folgenden schnaufend mit unseren Normdruck (190 MmH2O Höhe), die Axone Start viele Perlen-wie Krampfadern entwickeln. Die Bildung von Krampfadern ist teilweise reversibel, dargestellt durch Regionen des Axons Rückkehr in ihre bereits aufgeblasen Zustand nach einer 10 Minuten Erholungszeit (Abbildung 2A-B). Nach längerer Zeit der Erholung (> 20 min), einige Axone ...

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A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Dieses Protokoll beschreibt eine physiologisch relevante, unter Druck stehende flüssige Ansatz für schnelle und reversible Induktion von Krampfadern in den Neuronen.

Ein Microbiomechanical-System für das Studium Varizen-Bildung und Erholung in zentralen Neuronen Axone

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

a-microbiomechanical-system-for-studying-varicosity-formation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.2K Aufrufe.  The Ohio State University. Dieses Protokoll beschreibt eine physiologisch relevante, unter Druck stehende flüssige Ansatz für schnelle und reversible Induktion von Krampfadern in den Neuronen.

Serie: A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medizin

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Inducing Axonal Varicosities with a Micromechanical Stimulus on Neurons

Source: Servello, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57202">A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the induction of axonal varicosities by applying micromechanical stimulus on neurons. The system comprises a micropipette attached to a syringe containing buffer via tubing. Using a micromanipulator, the micropipette is positioned above the neurons. Fluid pressure is then applied to induce varicosities in axons.

Ein Microbiomechanical-System für das Studium Varizen-Bildung und Erholung in zentralen Neuronen Axone

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone

Ein

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Induktion axonaler Varizen mit einem mikromechanischen Stimulus auf Neuronen