R.J.M. wird unterstützt durch ein Promotionsstipendium der AMC. Diese Forschung wurde von der niederländischen Krebsgesellschaft (KWF Grant UVA 2014-6839) unterstützt. Die Autoren danken Dr. A. Jonker für seine Hilfe bei der Erstellung des Protokolls.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien über die Verwendung von menschlichem Material des medizinisch-ethische Review Board of Academic Medical Center.
1. Vorbereitung der Zellen oder Gewebeschnitten
<ol><li>Zellen<ol>
<li>Trypsinize Zellen von Kultur Gerichte mit 1 mL Trypsin-EDTA 0,25 % für 5 min bei 37 ° C in einem 10 mm Petrischale und Zellen in einer 37 ° C Suspension von 50.000-200.000 Zellen/mL, abhängig von der Größe der Zellen zu bringen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Zellsuspension auf Mikroskopie Folien mit Cytospin Trichter in einem Cytocentrifuge bei 20 X g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Trocknen Sie die Cytospins für 24 h bei Raumtemperatur an der Luft. Dies betrifft keine Dehydrogenase-Aktivität. 5
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gewebeschnitte<ol>
<li>Gewebe von Patienten oder Tiere nach ethischen Genehmigungen zu extrahieren. 10 mm3 des Gewebes reicht für mehrere Experimente.</li>
		<li>Legen Sie die Teile des Gewebes in kleinen belüftete 2 mL Kunststoff Flaschen und Snap-Freeze die Fläschchen mit dem Stück des Gewebes in flüssigem Stickstoff.</li>
		<li>Speichern Sie die Fläschchen mit Gewebe Stücke bei −80 ° C bis zu Weiterverarbeitung.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Gel-artige Datenträger mit der Bezeichnung optimale Arbeitstemperatur (OCT), um die Gewebeprobe auf ein Futter, das schnell bis zu-20 ° C bis-25 ° C gefriert zu montieren, so dass Wasser Kristalle bilden kann.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Kryostaten für Schneid- und zuerst den Block auf das gewünschte Niveau Trimmen (idealerweise halb so breit wie eine Mikroskopie Glas-Folie, z.B. 5 x 5 mm).</li>
		<li>Verwenden Sie beim Schneiden Pinsel und eine Anti-Roll-Platte um zu verhindern, dass die Abschnitte Eisstockschießen nach oben.</li>
		<li>Gewebeproben in 6 bis 10 µm Dicke Abschnitte eine langsame, aber stetige Geschwindigkeit schneiden (1 s pro Abschnitt). Wenn ein Abschnitt richtig geschnitten wird, bleibt es flach auf dem Mikrotom Messer unter der Anti-Roll-Platte.</li>
		<li>Nehmen Sie 1-3 Abschnitte auf mikroskopischen Objektträger und bis zur Verwendung bei −80 ° C lagern. Die Anzahl der Abschnitte vorbereitet richtet sich nach der Größe der Gewebeprobe und die gewünschte Dicke der Abschnitte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Enzym Histo/Cytochemistry für lösliche Dehydrogenases
<ol><li>Vorbereitung Reaktion Puffer.<ol>
<li>100 mL Phosphatpuffer von den korrekten pH-Wert vorzubereiten (siehe Tabelle 1; jedes Enzym hat einen optimalen pH, an dem ihre Tätigkeit die höchste ist). Z. B. Mischen Sie Lösungen von 0,1 M KH2PO4 (sauer) und 0,1 M NA2HPO4 (unverwässert), bis ein Puffer mit den korrekten pH-Wert erfolgt.</li>
		<li>Wiegen Sie 18 g von Polyvinylalkohol (PVA) in den Phosphatpuffer unter einem Abzug, wie PVA staubig und giftig ist.<ol>
<li>Auflösen der 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer bei 100 ° C durch die Erwärmung des Puffers au Bain Marie (die Glasflasche in kochendes Wasser legen) und rühren, bis die PVA vollständig gelöst ist. Die Lösung wird dann mit kleinen Luftblasen transparent, die durch das Rühren entstehen. Es erfordert in der Regel ca. 15 min für die PVA aufzulösen. Hinweis: Die 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer ist zähflüssig und lässt sich auf 15 mL Puffer Reaktionsgefäßen mit einer breiten Pipette übertragen. Kurzfristiger Lagerung von 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer tritt bei ≥40 ° C und langfristige Lagerung (bis zu 2 Wochen) bei ≥ 60 ° C. 250 µL von 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer ist in der Regel für eine Cytospin Vorbereitung erforderlich, während 500 µL für eine Gewebe-Abschnitt erforderlich ist.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie tetrazoliumsalz Salz (NitroBT) Lösung. Für jeden 1 mL der Inkubation Medium 40 µL NitroBT Lösung ist erforderlich, bestehend aus 5 mg NitroBT (ein hellgelbes Pulver) aufgelöst in einer Mischung aus 20 µL Dimethylformamid (DMF) und 20 µL Ethanol, die eine leichte gelbe transparente Lösung sein wird. Hinweis: Da die Stabilität des NitroBT die niedrigste von allen notwendigen Reagenzien ist, empfiehlt es NitroBT Vorratslösung letzten vorzubereiten und die NitroBT zuerst in dem Reaktionsmedium auflösen.<ol>
<li>NitroBT in DMF und Ethanol durch Erhitzen in einer Glasflasche in kurzer Zeit auflösen (~ 10 s) mit dem Bunsenbrenner. Schütteln Sie das Fläschchen beim Heizen und lassen Sie die Durchstechflasche zu lange in der Flamme um Verdunstung zu verhindern.</li>
			<li>Machen 10 % zusätzliche NitroBT Lösung, um die Verdunstung von DMF und Ethanol bei der Auflösung zu ermöglichen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Schild der Elektronen Träger phenazinderivat Methosulfate (PMS) oder (1-Methoxy)-phenazinderivat Methosulfate (Komponenten) und Inkubation Medien mit m(PMS) von direktem Lichteinfall durch Alufolie umwickeln, um Speicher glasphiole.</li>
		<li>Bereiten Sie Reagenzlösungen gemäß Tabelle 1 vor , indem man sie in destilliertem H2O. Einige Reagenzien schnell untergehen, so bereiten sie so kurz vor dem Experiment wie möglich. Halten Reagenzlösungen auf Eis oder bei 4 ° C bis zur Verwendung.</li>
		<li>Bereiten Sie Inkubation Medien vor, wie in Tabelle 1 dargestellt und homogenisieren Sie die Lösung nach jedem Schritt durch sanftes rühren zu. Vermeiden Sie die Generierung von Luftblasen in der Inkubation Medium durch Rühren und halten den Spatel unter der Oberfläche des Mediums Inkubation unter Rühren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gewebeschnitte Inkubation Medium zuweisen<ol>
<li>Pre-warme Mikroskopie gleitet mit Cytospins oder Gewebeschnitte angebracht bei 37 ° C in einer Immunohistochemistry Inkubation Kammer für 15 min. Tauchen der Boden der Kammer Immunohistochemistry Inkubation mit warmem Wasser weiterhin eine Konstante Temperatur in der Inkubator.</li>
		<li>Sorgfältig zu brechen Sie oder Sägen Sie Pasteur Pipetten am Übergang von der schmalen, der Breite Teil ab. Regelmäßige Pasteur Pipetten sind zu schmal, um das zähflüssige Inkubation Medium Aspirieren, so dass dieser Schritt erforderlich ist, zu Pasteur Pipetten breit genug für die Aspiration des Mediums Inkubation.</li>
		<li>Wenden Sie 250-500 µL des Mediums entsprechende Bebrütung auf jeder Zelle Vorbereitung oder Gewebe Abschnitt auf Mikroskopie-Folien mit dem breiten Teil des einer Pasteurpipette an.</li>
		<li>Verwenden Sie die PIPETTENSPITZE um die Inkubation Medium gleichmäßig zu verteilen. Ignorieren Sie kleine Luftblasen in der Inkubation Medium, weil diese an die Oberfläche schwimmen und nicht die enzymatische Reaktion in der Zelle Vorbereitung oder Gewebe-Sektion auf der Mikroskopie-Folie beeinträchtigt.</li>
		<li>Einer vorgegebenen Dauer, je nach der Enzym-Kinetik und ihren Ausdruck in einer bestimmten Zelle Zubereitung der Zelle Vorbereitungen oder Gewebeschnitte auf die Mikroskopie-Folien im Inkubator (z. B. einer Gewebekultur Inkubator) 37 ° C inkubieren oder Gewebe (Tabelle 1). Halten Sie den Deckel der Immunhistochemie Inkubation Kammer geschlossen, um eine feuchte Umgebung um zu verhindern, dass die Reaktion Puffer Austrocknen zu pflegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Mikroskopie-Folien<ol>
<li>Tippen Sie auf überschüssige Inkubation Medium auf Gewebe.</li>
		<li>Mechanisch abspülen der Inkubation Medium aus der Mikroskopie-Folien in 60 ° C Phosphatpuffer pH 5,3, durch Verschieben der Mikroskopie-Folien nach oben und unten in den Puffer. Dadurch wird verhindert, die enzymatische Reaktion.</li>
		<li>Waschen Sie die Mikroskopie-Folien, indem man sie in 60 ° C Phosphatpuffer pH 5,3 für 20 min.</li>
		<li>Mechanisch waschen Sie die Mikroskopie-Folien in Leitungswasser 60 ° C.</li>
		<li>Waschen Sie die Mikroskopie-Folien, indem man sie in Leitungswasser 60 ° C für 20 min.</li>
		<li>Lassen Sie das Wasser und Folien durch das Mischen von Wasser aus dem Wasserhahn mit Wasser aus dem Wasserhahn 60 ° C Raumtemperatur langsam im Laufe von 1 Minute abkühlen.</li>
		<li>Führen Sie eine abschließende mechanische Waschschritt in Raumtemperatur destilliertes Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schließen Sie den gefärbten Cytospins oder Gewebeschnitte auf Mikroskopie Folien<ol>
<li>Eine Folie wärmer bei 50-60 ° c Vorwärmen</li>
		<li>Vorsichtig trocknen Sie die Rückseite der Mikroskopie Folien mit einem Papiertuch und legen Sie sie auf der Folie wärmer an die Oberseite der Mikroskopie Folie trocknen.</li>
		<li>Wenn Sie die Folien trocken sind, fügen Sie Zelle Vorbereitungen oder Gewebeschnitte auf Mikroskopie Folien mit Glycerin Gelee Eindeckmittel und Deckgläsern.</li>
		<li>Speichern Sie die Zelle Vorbereitungen oder Gewebe Abschnitte Mikroskopie Folien im Dunkeln im Kühlschrank bei 4 ° C oder gehen Sie sofort mit Bildaufnahme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. die Bildaufnahme
<ol><li>Aufnahme von Bildern mit einer wissenschaftlichen monochrome CCD-Kamera mit genügend Dynamikumfang (mindestens 8-Bit aber vorzugsweise 10-Bit oder 12 Bit), festen Gewinn und eine lineare Reaktion.</li>
	<li>Wählen Sie eine richtige Ziel (20 X-63 X für Cytospins) und 10-63 X für Gewebeschnitten.</li>
	<li>Blendung durch die Verengung der Leuchtfeldblende, so dass es etwas größer als das Sichtfeld.</li>
	<li>Monochromatisches Licht durch die Anwendung einer 10 nm breite Inferenz Bandpassfilter in der Nähe der Isobestic Wellenlänge der Formazan Niederschlag7 in Kombination mit einer Infrarot-Blockierung Filtern (siehe Materialtabelle) Verwendung. Hinweis: Die maximale Isobestic-Absorption des NitroBT befindet sich in 585 nm.</li>
	<li>Optimierung der Beleuchtung um sicherzustellen, dass die gesamte graue Pegelbereich der Kamera verwendet wird (d. h. die Beleuchtungsstärke so eingestellt, dass maximale Ausleuchtung erreicht ist, ohne übermäßig auszusetzen, wenn Sie einen leeren Objektträger aufnehmen).</li>
	<li>Gemessenen Graustufen zu bekannten Extinktion (oder optische Dichte [OD]) Werte zu kalibrieren. Zu diesem Zweck erfassen Graustufen-Bilder von mindestens 10 verschiedenen Schritten einer Kalibrierungs-Dias oder Schritt tablet mit bekannten OD-Werte (siehe Punkt 4.1.1), entweder im Handel erhältlich (siehe Materialtabelle) oder Messen einen maßgeschneiderte Grauskala Keil Schritt Tablet durch einen Densitophotometer und verwenden Sie die Ergebnisse zur Kalibrierung gemessen grau auf bekannten Absorption Werte.</li>
	<li>Mikrofotos von Zellen oder Gewebe Abschnitte von Interesse zu erfassen.</li>
</ol>(4) Bildanalyse
<ol><li>Kalibrieren Sie vor der Bildanalyse die ImageJ-Software zur Messung der Extinktion.<ol>
<li>Die Extinktion (OD) der Mikrofotos von mindestens 10 Kalibrierung Gebieten mit bekannten Extinktion Parameter in die Kalibrierung Folie oder Schritt-Tablette mit bekannten OD-Werte zu messen. Verwenden Sie in ImageJ die Analyze → Maßnahme Menü oder Hotkey STRG + M um einen ausgewählten Bereich zu messen.</li>
		<li>Starten die Extinktion Kalibrierung zu analysieren → Kalibrierung. Wählen Sie die Funktion "Rodbard (NIH Image)". In der linken Spalte des Fensters, das geöffnet wird, sind die Ergebnisse der grauen Messungen von jedem Schritt der Kalibrierung Folie/Schritt Tablette in 4.1.1 durchgeführt bereits vorhanden. Wenn dies nicht der Fall ist, kopieren Sie sie aus dem Ergebnisbildschirm ImageJ. Geben Sie in der rechten Spalte jeder entsprechenden bekannten Extinktion Wert gedruckt auf dem Zertifikat erhalten Sie mit dem kalibrierten Schritt Tablet. Kreuzen Sie Boxen "globale Kalibrierung" und "Show-Plot" und drücken Sie "OK".</li>
		<li>Für die Qualitätskontrolle, stellen Sie sicher, die R-2 der Rodbard Funktion ist > 0,99. Wenn es ist < 0,99, überprüfen Sie, ob die Kalibrierung Dias fotografiert und richtig gemessen wurden und ob die bekannten Extinktion Parameter richtig eingegeben wurden.</li>
		<li>ImageJ ist nun kalibriert, bis Sie das Programm schließen (daher "Global-Kalibrierung"). Für Absorption Messungen einer kalibrierten ImageJ-Sitzung immer wandelt, die beobachteten Extinktion auf Werte zwischen 0 und 1, wobei 0 bedeutet, 1 sind die Asymptoten von NULL und vollständige Absorption, bzw..</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie für Cytospins, > 100 Einzelzellen in zufälliger Weise. Wählen Sie für Gewebekapitel ein oder mehrere Felder des Interesses der eine feste Länge und Breite in allen Bereichen.<ol>
<li>Projekt ein Raster über die Vergößerung, unvoreingenommene Zelle Auswahl zu unterstützen. In ImageJ Projekt ein Raster über ein Bild über die Plugins → analysieren → Raster Menü.</li>
		<li>Verwenden Sie in ImageJ elliptischen Werkzeug, um einzelne Zellen auswählen und verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug um Gewebe Regionen auswählen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie die Absorption und Bereich der ausgewählten Zellen oder Gewebe Regionen. Die optische Dichte und Bereich nennt man "Bedeuten" und "Area" in der ImageJ Ergebnisse Tabelle bzw.. Hinweis: Die totale Absorption einer Zelle oder eines Gewebes Region (wenn Sie mehrere Gewebe Regionen mit unterschiedlichen Größen ausgewählt haben) ist gleich der Summe aller getrennt Pixel Absorptionswerte. Wenn eine Zelle von 1000 Pixel abgebildet ist, dann die totale Absorption ergibt sich aus der Summe von 1000 Absorptionswerte und die mittlere Absorption wird durch totale Absorption/1000 gegeben. Dieses Verfahren wird auch Verteilungswirkungen Fehler vermieden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die durchschnittliche totale Absorption von > 30 Zellen oder Gewebe Regionen von Kontrolle Foliennummer, enthält eine Probe, die ausgesetzt wurde, um Inkubation Medium in Abwesenheit des Substrats aber im Beisein von Cofaktoren zu kontrollieren. Diese Kontrolle Extinktion dient zur Kontrolle für unspezifische Enzym Aktivität Färbung und Extinktion Artefakte durch die verwendeten Mikroskopie Folien, Montage, Medium, Deckglas oder Mikroskop induziert.</li>
	<li>Subtrahieren Sie die durchschnittliche Kontrolle Absorption von allen total Absorption Messungen von Proben, die Inkubation Medium mit der gleichen Konzentration der Cofaktor (aber unterschiedlichen Konzentrationen von Substrat und/oder Inhibitor) ausgesetzt waren. Dadurch werden die korrigierten totale Absorption einer Zelle oder eines Gewebes Region.</li>
	<li>Vergleichen Sie statistisch die durchschnittliche korrigierte total Absorptionswerte mit der Student T-Test oder One-Way ANOVA-Test, je nach Ihrem experimentellen Design.</li>
	<li>Formazan Absorption kann umgebaut werden Enzym-Aktivität (umgerechnet µmol Substrat pro mL / min.) verwenden das Gesetz von Lambert-Beerschen: c=A/(є×d), wo c ist die Konzentration von Formazan in dem Reaktionsmedium, A ist die gemessene Extinktion in ImageJ nach der Kalibrierung; Є ist vom Aussterben bedroht-Koeffizient von Formazan (16.000 auf 585 nm)8 und d ist das Licht Reisen Distanz, die die durchschnittliche Zelle Dicke oder nominale Abschnitt Schnittstärke (6 bis 10 µm in diesem Protokoll) entspricht. Hinweis: Nach dem Trocknen verringert Gewebe Schnittdicke ca. 50 % von der nominalen Abschnitt Schnittstärke, aber dies spiegelt sich nicht in die Berechnung oben weil die nominalen Abschnitt Schnittstärke biologisch am relevantesten ist. Die durchschnittliche Zelle Dicke und Kugel Dimensionen der Zelle, die Mikroskopie-Glas-Objektträger Präparaten eingehalten können bestimmt werden, mit der konfokalen Mikroskopie oder Weitfeld-Mikroskopie, für die Protokolle an anderer Stelle gefunden werden können. 9 , 10
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).</li><li>Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+enzymes+at+work:+metabolic+mapping+by+enzyme+histochemistry.">Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathobiology of Human Disease. , 3760-3774 (2014).</li><li>Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry:+protocols+for+2D+and+3D+quantification+in+microscopic+images.">Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images.</a> Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , (1992).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G., Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. , 355-432 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytophotometry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+cells.">Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells.</a> Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).</li><li>Butcher, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+in+tissue+sections+of+the+two+formazans+derived+from+nitroblue+tetrazolium+in+dehydrogenase+reactions.">The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions.</a> Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).</li><li>Matsumoto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biological applications of confocal microscopy. , (2002).</li><li>Errington, R. J., White, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamic+cell+volume+in+situ+by+confocal+microscopy.">Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).</li><li>Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driver+and+passenger+effects+of+isocitrate+dehydrogenase+1+and+2+mutations+in+oncogenesis+and+survival+prolongation.">The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).</li><li>Molenaar, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotection+of+IDH1-Mutated+Cancer+Cells+by+the+IDH1-Mutant+Inhibitor+AGI-5198.">Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198.</a> Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).</li><li>Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+gene+expression+analysis+reveals+glycolysis+and+acetate+anaplerosis+in+IDH1+wild-type+glioma+and+lactate+and+glutamate+anaplerosis+in+IDH1-mutated+glioma.">In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma.</a> Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).</li><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Webb, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , (1992).</li><li>Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phosphate-activated+Glutaminase+Activity+and+Its+Kinetics+in+Mouse+Tissues+using+Metabolic+Mapping+(Quantitative+Enzyme+Histochemistry).">Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry).</a> J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).</li><li>van Lith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+as+chemotactic+fuel+for+diffuse+glioma+cells:+are+they+glutamate+suckers?.">Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers?.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Forschung am Zellstoffwechsel erlebt derzeit eine Renaissance, weil Forscher erkennen jetzt, dass metabolische Effekte entscheidend für die Pathogenese und Behandlung vieler Krankheiten sind. 1 im übrigen metabolischen Forschung wird durch eine steigende Verfügbarkeit von Techniken unterstützt, die diesem Forschungsfeld mit mehr Werkzeuge als je zuvor, einschließlich der Massenspektrometrie, Radioisotopen Kennzeichnung und Kernmagnetische Resonanz-Spektrometrie zur Verfügung zu stellen. Metabolische Mapping ist keine neuartige Technik, aber ihre Fähigkeit, integrierte Informationen über die Aktivität der Enzyme in einer fast True-to-Nature-Situation geben macht diese Technik aktueller denn je. 2
Die Cofaktoren NAD+ und NADP+ finden sich in allen lebenden Zellen, was darauf hindeutet, dass Dehydrogenases sehr früh im Laufe der Evolution entstanden und haben wichtige Rolle im Zellstoffwechsel. 14 , 15 es derzeit 523 Enzym-katalysierten Reaktionen, die als Dehydrogenases eingestuft und über alle Arten auftreten. 16 theoretisch kann die Aktivität aller verschiedenen Dehydrogenase Reaktionen getrennt untersucht werden durch die Feinabstimmung der metabolischen Zuordnung Protokolls hier beschrieben. Jede Enzymreaktion ist einzigartig durch das Substrat und Co-Faktoren, die für ihre Tätigkeit erforderlich sind. Daher kann die Aktivität der einzelnen enzymatischen Reaktion mit einem metabolischen Mapping Experiment mit ausreichend Substrat und Cofaktoren in dem Reaktionsmedium ermittelt werden. Jedoch einige Enzym-Isoformen unterscheiden sich in ihrer subzelluläre Lokalisation, z.B. eine Isoform katalysiert eine Reaktion im Zytoplasma, während ein anderes Isoform in den Mitochondrien Funktionen. Ein bemerkenswertes Beispiel ist IDH1 und IDH2, von denen erstere zytoplasmatischen ist und Letzteres ist mitochondriale und das sind zwei verschiedene Proteine, die von zwei verschiedenen Genen kodiert. 11 1-Methoxy-5-Methylphenazinium Methylsulfate (Methoxy-PMS) und 5-Methylphenazinium Methylsulfate (PMS) können sowohl als Elektron Träger für diese Experimente verwendet werden. Die ehemalige übergibt keine mitochondriale Membranen, die letztere tut. Daher sollten Untersuchungen zur mitochondrialen Enzyme (z.B. IDH2) PMS verwenden, während Untersuchungen zur zytosolischen Enzyme (z.B. IDH1) Komponenten verwenden sollten.
Wie bei vielen Techniken, Variationen dieses Protokolls, wie z. B. die Verwendung unterschiedlicher Arten von tetrazoliumsalz Salze, ausgenommen die Zugabe von PMS und Natriumazid, mit einer wässrigen Eindeckmittel und unterschiedliche Inkubationszeit und spülen Zeiten existieren und funktionieren genauso gut. Die Anwendung der metabolischen Mapping mit tetrazoliumsalz Salze beschränkt sich nicht auf Dehydrogenases. Mit kleinen Änderungen des Protokolls, kann es auch verwendet werden, für die Beurteilung der Aktivität von Enzymen, die funktionieren, direkt oberhalb der Dehydrogenase in einem Stoffwechselweg. Haben wir zuvor beschrieben, dieses Prinzip für die Glutaminase Enzym,17 die Funktionen direkt oberhalb des Glutamat-Dehydrogenase in den Glutaminolysis Weg. 18 in der Theorie, kann das gleiche Prinzip angewendet werden um andere Enzyme, die Funktion direkt nachgeschalteten oder oberhalb des eine Dehydrogenase z.B. Aconitase, liegt direkt oberhalb des IDH2 und IDH3 in der tricarboxylic Säure (TCA) Zyklus. Eine weitere einfache Variante der Konzentrationen in Tabelle 1 beschrieben ist durch Inkubation mittlere Fläschchen mit verschiedenen Konzentrationen von Substrat, Cofaktor und/oder Inhibitor zu machen. Dies ermöglicht die Erzeugung von Dosis-Aktivität Kurven in Abhängigkeit von Substrat, Cofaktor und/oder Hemmung Konzentration.
Technisch gesehen, metabolische Zuordnung Experimente erleichtern nicht unvoreingenommene Beobachtungen von in Situ Enzymaktivität, weil Forscher haben eine Konzentration von Substrat und Cofaktor wählen, die nicht das Substrat und Cofaktor Ebene reflektieren kann Das sind vorhanden in Situ. Darüber hinaus die Verwendung von Viskose 18 % PVA in dem Reaktionsmedium dient um Makromoleküle, im Ort und in der Konformation intakt aber effektive Verbreitung der niedrigen Molekulargewicht Reagenzien durch das Reaktionsmedium verbietet. 3 , 5 daher entschlossen Enzymaktivitäten in die hier beschriebenen Experimente, mit denen Supraphysiological Substrat Konzentrationen spiegeln nicht die in-Vivo -Situation bei einer bestimmten Substratkonzentration aber eignen sich für Intra experimentelle Vergleiche. So ist das Ergebnis metabolische Zuordnung Versuchsreihe die Produktionskapazität (maximale Aktivität) einer enzymatischen Reaktion im Zusammenhang mit der Substrat- und Cofaktor Ebenen, die Gegenwart in Situ. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von Substrat und/oder Cofaktoren und mehrere Proben unvoreingenommenen Vergleich der maximale Produktionskapazität (Vmax) und (Km) Affinität eines Enzyms zum Substrat/Cofaktor in Zelle Vorbereitungen , Gewebe oder Gewebe Regionen. Diese Parameter sind das Ergebnis der Summe der Enzym-Protein-Expression, Post-translationalen Modifikationen und die Wirkung von einem überfüllten Mikroumgebung auf die Aktivität von Enzymen. Daher ist metabolische Zuordnung noch eine bessere Reflexion der Enzym-Aktivität als Experimente, die Protein-Expression zu bestimmen oder Enzym-Aktivität in Vitrogereinigt.

Stoffwechsel ist ein wesentlicher Eckpfeiler der Zellphysiologie. Stoffwechsel versorgt die Zellen mit Energie für alle physiologischen Prozesse, liefert die Bausteine für Makromolekulare Biosynthese und regelt die zelluläre Homöostase in Bezug auf Abfallprodukte, toxische Moleküle und die Demontage und Recycling von unnötig oder dysfunktionalen Zellkomponenten. Enzyme fast alle wichtige zelluläre Chemische Reaktionen katalysieren und daher sind die motorischen Einheiten in der Physiologie der Zellen. 1 , 2
Die Aktivität von Enzymen ist streng reguliert, auf vielen Ebenen und quantitative Enzym Histochemie und Cytochemistry (auch metabolische Mapping genannt) ist daher die bevorzugte Methode, Enzym-Aktivität in Situzu studieren. Auf transkriptioneller Ebene wird die Genexpression in mRNA geregelt. Die Wirkung der Regulierung der Transkription kann durch quantitative mRNA-Assays, wie qualitative mRNA-Assays, z. B. in-Situ -Hybridisierung, die Informationen über die (Teil-) zelluläre Microarrays oder direkte RNA Sequenzierung bestimmt werden Lokalisierung von mRNA-Moleküle. Dies macht es möglich, relative Unterschiede in transkriptionelle Aktivität zwischen den Zellen zu schätzen. Jedoch ist die Auslegung und Gültigkeit dieser mRNA-Assays in Bezug auf die Stoffwechselaktivität kompliziert, weil Verordnung tritt auch auf der mRNA-Ebene, wo Sequenz und die Stabilität der mRNA-Moleküle bearbeitet werden, nachdem es von der DNA transkribiert wird. Diese Bearbeitung regelt Protein Isoform Übersetzung und Protein Übersetzung Menge an den Ribosomen. Darüber hinaus der Prozess der Protein-Übersetzung wird kontrolliert und schließlich betrifft enzymexpression und damit Aktivität. Die kombinierte Wirkung der oben genannten rechtlichen Schritte können geschätzt werden, mithilfe von quantitativen Protein Ausdruck Assays, wie Western Blot oder umgekehrter Phase Protein lysate Microarrays oder qualitative Protein Ausdruck Assays, wie Immunocytochemistry und Immunohistochemistry, aber diese Techniken nicht nachgelagerten regulatorische Effekte wie z. B. Post-translationale Modifikation von Proteinen und der funktionelle Regulation der Enzyme in den überfüllten Mikroumgebung zu integrieren. Darüber hinaus kann der Ausdruck eines Enzyms schlecht mit seiner Aktivität korrelieren, so dass Messungen der Aktivität eines gereinigten Enzyms in Zelle oder eines Gewebes Homogenates oder in verdünnten Lösungen für Enzym-Aktivität Studien am meisten benutzt sind. Aber nicht diese Experimente, den Einfluss eines überfüllten Abteilen Zytoplasma oder Organellen auf die Aktivität eines Enzyms zu replizieren. Darüber hinaus alle oben genannten Techniken die Menge oder die Lokalisierung von mRNA oder Enzym Ausdruck festlegen, aber sind nicht in der Lage, umfassende Informationen über diese beiden Aspekte von enzymexpression, geschweige denn die Integration dieser zu geben Informationen mit Enzym-Aktivität-Bestimmungen. 2 , 3 , 4
Metabolische Mapping erlaubt es, die Wertschätzung aller von den oben genannten Variablen, die die Aktivität eines Enzyms zu ermitteln. Darüber hinaus ist metabolische Zuordnung eine Form von lebenden Zellen oder Gewebe Bildgebung mit Zellen und Geweben, die während der Analyse eine fast True-to-Nature-Situation um Daten der Aktivität von Enzymen zu generieren generieren intakt gehalten werden. Es produziert Bilder, die sowohl die detaillierte Aufwertung des Standortes der Enzym-Aktivität sowie robuste Quantifizierung der Enzym-Aktivität innerhalb einer Zelle oder eines Gewebes Fach zu erleichtern. 3 , 4 die Protokolle, die hier beschriebenen für metabolische Zuordnung der Tätigkeit des Dehydrogenases basieren auf den Labor-Handbuch aller verfügbaren Enzym histochemische Methoden,5 auf den Grundsätzen der quantitativen Enzym Histochemie,6 und auf Bildanalyse von quantitativen metabolische Zuordnung. 4
Dehydrogenases sind Enzyme, die Redox-Reaktionen bzw. Verringerung des kanonische Cofaktoren wie+NAD, NADP+ und FAD, NADPH, NADH und FADH2, durchzuführen. Intakte Zellen oder Gewebeschnitten Kryostat, die chemisch nicht behoben werden werden in einem Reaktionsmedium inkubiert enthält unter anderen Reagenzien, Substrat und Cofaktoren eine spezifische Dehydrogenase und eine Tetrazolium-Salz. Anschließend die Dehydrogenase führt seine katalytische Aktivität und zum Beispiel+ NADP zu NADPH reduziert. Über ein Elektron Träger reduzieren 2 NADPH Moleküle letztlich 1 wasserlösliche Semi-farblose tetrazoliumsalz Salz Molekül in 1 wasserunlöslichen blauen Formazan-Molekül, das sofort auf der Website der Dehydrogenase ausfällt. Daher die Extinktion der ausgefällten Formazan ist ein direktes Maß für die lokale Aktivität eine Dehydrogenase und kann Lichtmikroskopie beobachtet werden oder quantifiziert mit monochromatisches Licht Mikroskopie und Bildanalyse. Der quantitative Aspekt dieses Protokolls ermöglicht Forschern aus diesen Tests statistische Schlüsse zu ziehen. Diese Quantifizierung erleichtert darüber hinaus die Bestimmung der in Situ kinetische Enzym Parameter, wie z. B. die maximale Enzymaktivität (Vmax) und Affinität eines Substrats für ein Enzym (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Wenn Sie eine metabolische Mapping Experiment planen, ist es wichtig zu erkennen, dass pro Versuch, maximal 50 Objektträger mit anhaftenden Zelle Vorbereitungen oder Gewebeschnitte werden empfohlen, um zeitliche Verzögerungen während der Inkubation zu minimieren, um konsistent zu erhalten Ergebnisse. Es ist möglich, weitere Dias bzw. mittlere Kompositionen zu verarbeiten, wenn diese Protokoll-Schritte durch mehr als ein Experimentator kooperativ durchgeführt werden. Darüber hinaus besteht eine Variabilität zwischen Experimente. Daher identische Experimente sollten mindestens 3 Mal mit Cytospins von jeder Zelle Vorbereitung oder Abschnitte aus jede Gewebeprobe wiederholt werden und entsprechende Kontrollen in jedem Experiment aufgenommen werden sollten. Bereiten Sie immer eine Inkubation Steuermedium in Abwesenheit des Substrats aber im Beisein von Cofaktoren zu steuern für unspezifische Enzym Aktivität Färbung. Die repräsentativsten Ergebnisse in Experimenten wo verschiedene Substrat/Cofaktor Konzentrationen Gewebeschnitte oder Zelle Zubereitungen aus der gleichen Probe gelten damit der Experimentator Enzym Kinetik mit Analysen durchführen können Dosis-Aktivität Kurven.

<table><tbody><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose 6-phosphate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>Disodium hydrogen phosphate (NA&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck Millipore</td><td>106559</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium succinate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W327700</td><td></td></tr><tr><td>DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1252&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2300</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GG1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>Lithium 6-phospho-D-galactonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55962</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>methoxy-Phenazine methosulfate</td><td>Serva</td><td>28966.01</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide adenine dinucleotide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0505&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NADP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium Blue chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine methosulfate</td><td>Serva</td><td>32030.01</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1763</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck Millipore</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium L-lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter</td><td>Edmund optics</td><td></td><td>https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/</td></tr><tr><td>Grey-step wedge</td><td>Stouffer Industries</td><td></td><td>http://www.stouffer.net/TransPage.htm</td></tr></tbody></table>

metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues

Veränderten zellulären Stoffwechsel ist ein Markenzeichen von vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Krankheiten und Infektionen. Die metabolische Motoreinheiten der Zellen sind Enzyme und deren Aktivität ist stark reguliert, auf vielen Ebenen, einschließlich der transkriptionellen, mRNA Stabilität, translationale, Post-translationalen und funktionalen Ebene. Diese komplexe Verordnung bedeutet, dass herkömmliche quantitative oder bildgebenden Assays, wie quantitative mRNA Experimente, Western Blots und Immunohistochemistry, unvollständigen Informationen über die ultimative Aktivität der Enzyme, deren Funktion ergeben und/oder Ihre subzelluläre Lokalisation. Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie (z. B. metabolische Mapping) Aufschluss eingehenden darüber, in Situ enzymatische Aktivität und die Kinetik, Funktion und subzelluläre Lokalisation in einer fast True-to-Nature-Situation.
Wir beschreiben ein Protokoll, um die Aktivität der Dehydrogenases, zu erkennen, die Enzyme sind, die Redox-Reaktionen zur Reduzierung von Co-Faktoren wie NAD(P)+ und FAD durchführen. Zellen und Gewebe Abschnitte werden in einem Medium inkubiert, die spezifisch für die enzymatische Aktivität eine Dehydrogenase ist. Anschließend führt der Dehydrogenase, die Gegenstand der Untersuchung ist, seine enzymatische Aktivität in seinem subzelluläre Aufstellungsort. In einer chemischen Reaktion mit dem Reaktionsmedium erzeugt dies letztlich blau gefärbten Formazan am Standort der Dehydrogenase-Aktivität. Die Formazan Extinktion ist somit ein direktes Maß für die Dehydrogenase-Aktivität und mit monochromatisches Licht Mikroskopie und Bildanalyse quantifiziert werden kann. Der quantitative Aspekt dieses Protokolls ermöglicht Forschern aus diesen Tests statistische Schlüsse zu ziehen.
Neben Beobachtungsstudien kann diese Technik für Studien der Hemmung von bestimmten Enzymen verwendet werden. In diesem Zusammenhang Studien profitieren von den True-to-Nature-Vorteilen des metabolischen Mapping kann in Situ Ergebnisse geben, die physiologisch relevanter als in-vitro- Enzym Hemmung Studien sein. Alles in allem ist metabolische Zuordnung eine unverzichtbare Technik, Stoffwechsel Ebene der zellulären oder Gewebe zu studieren. Die Technik ist einfach zu verabschieden, fundierte, umfassende und integrierte metabolische informiert und ermöglicht schnelle Quantitative Analyse.

Mehrere Protokolle Inkubation Medium vorbereiten werden angezeigt, um die Aktivität einer bestimmten Dehydrogenase zu untersuchen. Für jede Dehydrogenase Auflösen der gelisteten Reagenzien in der PVA-Lösung unter Beibehaltung einer Temperatur von mindestens 37 ° C. Die Reagenzien in der Reihenfolge in der Tabelle aufgeführten aufgelöst werden sollte, d.h. NitroBT wird immer zuerst aufgelöst und (m) PMS ist immer zuletzt aufgelöst. Jeweils 5 mg NitroBT ist in 40 µL-Mischung (20 µL Ethanol + 20 µL Dimethylformamid) aufgelöst. Alle Bände sind pro 1 mL 18 % PVA-Lösung, die zum Fleck ~ 2 Gewebeschnitte oder ~ 4 Zelle Vorbereitungen auf Objektträgern verwendet werden kann. NitroBT, NAD+, NADP+, ADP und Substrat Lösungen sollten frisch gemacht werden. NaN3, MgCl2 und (m) PMS Lösungen können für einen Monat bei 4 ° C gelagert werden. 18 % PVA aufgelöst in Phosphat Puffer kann bei 60 ° C für 2 Wochen gelagert werden. Der pH-Wert der Lösung 18 % PVA kann über unterschiedliche Zusammensetzungen von 0,1 M Kalium Dihydrogen Phosphat (KH2PO4) und 0,1 M binatrium Wasserstoff Phosphat (NA2HPO4) Puffer eingestellt werden. Die gezeigten Inkubationszeiten bieten gute Ansatzpunkte, aber die optimale Inkubationszeiten hängen von den Arten, den Gewebetyp und den Erhalt des Gewebes. Zelle Vorbereitungen sollten in der Regel länger als Gewebeschnitte auf ein ähnliches Niveau der Formazan Produktion zu erhalten inkubiert werden.
Wildtyp Isocitrate Dehydrogenase 1 und 2 (IDH1/2) katalysieren die Umwandlung von Isocitrate in α-Ketoglutarate (αKG) mit gleichzeitiger Reduzierung der+ NADP zu NADPH im Zytoplasma und Mitochondrien, beziehungsweise. Diese Enzyme haben vor kurzem erregte, weil IDH1/2 in verschiedenen Arten von Krebserkrankungen Mutationen, einschließlich primäre Hirntumoren (Glioblastom) und kolorektales Karzinom, und bieten eine einzigartige Gelegenheit, die Möglichkeiten des metabolische Zuordnung. IDH1 -Mutationen IDH1-Wildtyp Enzym-Aktivität zu deaktivieren und auch induzieren eine Neo-Enzymaktivität, das führt zu die Produktion und anschließende Akkumulation von Oncometabolite D-2-Hydroxyglutarate (D-2-HG),11 , an anderer Stelle erläutert ausführlich. 12 metabolische Zuordnung Experimente zeigten, dass NADP+-abhängige IDH1/2 Aktivität war signifikant niedriger in kolorektalen Karzinomzellen mit einer klopfte in heterozygoten IDH1 Mutation als in kolorektalen Karzinomzellen, die IDH1 Wildtyp (Abbildung 1A). Dieser Unterschied wurde durch die Bildanalyse von monochromatisches Licht oberflächenmustern (Abbildung 1 b) quantifiziert. 12
Ein weiteres Beispiel zur Veranschaulichung metabolische Zuordnung Experimente zeigt Abbildung 2, die ein Bild von einem Kryostat Abschnitt des Gehirn der Maus, die mit menschlichen Glioblastom-Zellen injiziert wurde. IDH1/2 ist der wichtigste Anbieter von NADPH im menschlichen Gehirn und seine Tätigkeit hochreguliert in Wildtyp IDH1/2 Glioblastom, während die NADPH-Produktionskapazität von IDH1/2 in den Gehirnen von Nagetieren viel niedriger ist. 11 Abbildung 2A zeigt die Differenz zwischen den hohen NADP+-abhängige IDH1/2-Aktivität in menschlichen Glioblastom-Zellen und die niedrigen NADP+-abhängige IDH1/2-Aktivität im Gehirn gesunde Maus. IDH1/2 Aktivität wird als µmol NADPH Produktion pro mL Gewebe pro Minute in Abbildung 2 bquantifiziert.
Die enzymatische Reaktion des IDH1/2 ist relativ einfach, aber Laktat-Dehydrogenase (LDH) ist ein komplizierter Enzymkomplex. LDH wandelt die reversible Umwandlung von Laktat in Pyruvat mit gleichzeitigen Reduktion von NAD+ , NADH oder umgekehrt. Die Verfügbarkeit von Laktat und Pyruvat und die Zusammensetzung der LDH Enzymkomplex bestimmt, ob Laktat in erster Linie zu Pyruvat umgewandelt wird (das ist katalysiert durch LDH-B und liefert NADH) oder ob Pyruvat in erster Linie um Laktat umgewandelt wird (das ist katalysiert durch LDH-A und NADH verbraucht). 13 metabolische Zuordnung Experimente sind in der Lage, die Aktivität der LDH-B Reaktion zu visualisieren, aber sie sind "blind" auf die Aktivität der LDH-A-Reaktion, denn NADH Produktion tritt nicht auf, und folglich ist NitroBT nicht auf Formazan reduziert. Abbildung 3 zeigt die NAD+-abhängige LDH-Aktivität (d. h. die Umwandlung von Laktat in Pyruvat) im menschlichen Gehirn Abschnitte in der Abwesenheit des Substrats (Abbildung 3A), in der Gegenwart eine hohe Konzentration von Laktat (Abbildung 3 b ), in Anwesenheit von 6 mM Laktat (Abbildung 3) und in der Gegenwart eine niedrige Konzentration von Laktat und eine höhere Konzentration von Pyruvat (Abbildung 3D). Die Ergebnisse dieser Experimente veranschaulichen metabolische Zuordnung ausreichend erfasst, die die NAD+-abhängige LDH-Aktivität in Gewebeschnitten hängt von der Verfügbarkeit von Laktat und Pyruvat in dem Reaktionsmedium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig1.jpg">
Abbildung 1 . +NADP-abhängige IDH1/2 Aktivität des menschlichen kolorektalen Karzinomzellen. (A) repräsentative monochromatisches Licht Mikrofotos HCT116 menschlichen kolorektalen Karzinoms Zellen nach der Färbung für NADP+-abhängige IDH1/2 Aktivität gegen 1-10 mM Isocitrate und 0,8 mM NADP+. Skalieren Sie Bars = 50 µm. (B) eine Quantifizierung der Absorption des blauen Formazan produziert von NitroBT von+NADP-abhängige IDH1/2 Aktivität pro Zelle ist mit dem Einsatz von monochromatischem Licht in (A) und Bildanalyse gezeigt. Abkürzungen: IDH1WT/WT, Isocitrate Dehydrogenase 1 Wildtyp; IDH1WT/MUT, Isocitrate Dehydrogenase 1 mutiert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig2.jpg">
Abbildung 2 . +NADP-abhängige IDH1/2 Aktivität des menschlichen Glioblastom Proben. (A) repräsentative Mikrophotographie eines Maus-Gehirn-Abschnitts mit gesunden Mäusegehirn (h) und einem menschlichen Glioblastom Tumor Xenograft (t) nach der Färbung für NADP+-abhängige IDH1/2 Aktivität im Beisein von 0,8 mM NADP+ und 2 mM Isocitrate. Maßstabsleiste = 200 µm (B) Enzym-Aktivität Quantifizierung Mäusegehirn (h) und menschlichen Glioblastom Xenograft (t) in (A) mit dem Gesetz von Lambert-Beerschen gezeigt. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig3.jpg">
Abbildung 3 . NAD+-abhängige Laktat-Dehydrogenase (LDH) Aktivität des menschlichen Gehirns Proben. Repräsentative Mikrofotos von Schnittserien des menschlichen Gehirns Proben nach der Färbung für NAD+-abhängige LDH-Aktivität (A) gegen Kontrolle Bedingungen (in Abwesenheit Substrat und Pyruvat, 3 mM NAD+ nur) (B) gegen 150 mM Laktat in Pyruvat (C) gegen 6 mM ohne Laktat in der Abwesenheit von Pyruvat und (D) gegen 6 mM Laktat in Anwesenheit von 18 mM Pyruvat, konkurrenzfähiges Produkt Inhibitor der Laktat, Pyruvat Reaktion. Maßstabsleiste = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enzym:</td>
			<td>G6PDH</td>
			<td>LDH</td>
			<td>SDH</td>
			<td>MDH</td>
			<td>IDH1</td>
			<td>IDH2</td>
			<td>IDH3</td>
			<td>6PGD</td>
			<td>GDH</td>
		</tr>
<tr>
<td>PVA 18 % in 100 mM Phosphat-Puffer</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL;  pH = 7,4</td>
			<td>1 mL;  pH = 8,0</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL; pH = 7,4</td>
			<td>1 mL; pH = 8,0</td>
			<td>1 mL; pH = 8,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NitroBT</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
			<td>5 mg/40 µL Mischung</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NaN3 </td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM MgCl2</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM NAD+</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,8 mM NADP</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM ADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Substrat</td>
			<td>10 mM Glukose-6-Phosphat</td>
			<td>150 mM Laktat</td>
			<td>50 mM Succinat</td>
			<td>100 mM-Apfelsäure</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>10 mM 6-Phospho-galactonate</td>
			<td>10 mM Glutaminsäure</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,32 mM Komponenten</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,2 mM PMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dauer der Inkubation</td>
			<td>5 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>60 min.</td>
			<td>60 min.</td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>10 min</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
</tbody></table>
Tabelle 1. Schematische Übersicht des metabolischen Mapping-Protokolls für Dehydrogenases. Abkürzungen: ADP Adenosin Diphosphat; (m) PMS (Methoxy)-5-Methylphenazinium-Methyl-Sulfat; NitroBT, Nitro tetrazoliumsalz blau Chlorid; G6PDH, Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase; LDH, Laktat-Dehydrogenase; SDH, Succinat-Dehydrogenase; MDH, Malat-Dehydrogenase; IDH, Isocitrate Dehydrogenase; 6PGD, 6-Phosphogluconate-Dehydrogenase; GDH, Glutamat-Dehydrogenase.

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Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, zu mikroskopisch visualisieren und Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben und die Kinetik, Funktion und subzelluläre Lokalisation zu quantifizieren.

Metabolische Mapping: Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie die Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben zu bestimmen

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Serie: Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Forschung

Biochemie

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein film electrochemistry, in which a protein is immobilized on an electrode surface such that the electrode replaces physiological electron donors or acceptors, has provided functional insight into the redox reactions of a range of different proteins. Full chemical understanding requires electrochemical control to be combined with other techniques that can add additional structural and mechanistic insight. Here we demonstrate a technique, protein film infrared electrochemistry, which combines protein film electrochemistry with infrared spectroscopic sampling of redox proteins. The technique uses a multiple-reflection attenuated total reflectance geometry to probe a redox protein immobilized on a high surface area carbon black electrode. Incorporation of this electrode into a flow cell allows solution pH or solute concentrations to be changed during measurements. This is particularly powerful in addressing redox enzymes, where rapid catalytic turnover can be sustained and controlled at the electrode allowing spectroscopic observation of long-lived intermediate species in the catalytic mechanism. We demonstrate the technique with experiments on E. coli hydrogenase 1 under turnover (H2 oxidation) and non-turnover conditions.

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Here, we describe a technique, protein film infrared electrochemistry, which allows immobilized redox proteins to be studied spectroscopically under direct electrochemical control at a carbon electrode. Infrared spectra of a single protein sample can be recorded at a range of applied potentials and under a variety of solution conditions.

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Ecotoxicological Methodologies to Evaluate Biomarkers at Different Scales in Neotropical Anurans

The new questions in ecotoxicology highlight the importance of applying a battery of biomarkers, as this results in ecotoxicological predictions that improve not only the interpretation of the effects of environmental stressors on organisms but also the determination of their possible impact. It is well known that the use of ecotoxicological biomarkers at different levels of organization allows for the prediction of the biological responses of organisms to environmental stressors, which is useful in environmental risk assessment. 
Nevertheless, it is necessary to consider the optimization of basic procedures, to generate historical data in control groups, and to employ specific bioassays to evaluate responses in organs and tissues in order to elucidate the nature and variation of the effects observed. Therefore, the present work aims to describe several ecotoxicological methodologies employed in all stages of neotropical anurans at different ecological levels and to validate them as useful biomarkers to be used both in wildlife and in laboratory conditions. In this work, these biomarkers were applied at the individual/organismic level (body condition index), histological/physiological level (histopathology, histometric, and pigmentary analyses), biochemical level (oxidative stress enzymes), and genetic level (direct and oxidative damage in DNA by comet assay). 
Although these methodologies have small variations or modifications depending on the species, these techniques provide effective biomarkers for evaluating the effect of xenobiotics on anurans, which possess certain characteristics that make them useful indicator species of aquatic and terrestrial ecosystems. In conclusion, the battery of biomarkers employed in the present study has proven to be adequate for estimating toxic responses in Neotropical anurans and can be further recommended as bioindicators for identifying the impact of pollutants on the aquatic ecosystems of the region. Finally, it is recommended to achieve the standardization of these important biomarkers for anurans in specific regions as well as to possibly include them in risk assessments and decision-making.

<meta charset="utf8"></head><body>Ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern auf verschiedenen Skalen in neotropischen Anuren

In this paper, standardized ecotoxicological methods for the evaluation of biomarkers in neotropical anuran species are presented. Specifically, this paper details several methodologies at different scales of ecotoxicological evaluation, such as the genetic, cellular-histological, biochemical, morphological, and individual levels.

Ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern auf verschiedenen Skalen in neotropischen Anuren

The new questions in ecotoxicology highlight the importance of applying a battery of biomarkers, as this results in ecotoxicological predictions that ...

Umwelt

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and progression. Complexity within the tumor microenvironment, including tumor secretome, low-grade inflammation, hypoxia, and redox imbalance, fosters heterotypic interaction and allows the transformation of inactive resident fibroblasts to become active CAFs. CAFs are metabolically distinguished from normal fibroblasts (NFs) as they are more glycolytically active, produce higher levels of reactive oxygen species (ROS), and overexpress lactate exporter MCT-4, leading to the opening of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP). Here a method has been described to analyze the mitochondrial health of activated CAFs isolated from the multicellular 3D tumor spheroids comprising of human lung adenocarcinoma cells (A549), human monocytes (THP-1), and human lung fibroblast cells (MRC5). Tumor spheroids were disintegrated at different time intervals and through magnetic-activated cell sorting, CAFs were isolated. The mitochondrial membrane potential of CAFs was assessed using JC-1 dye, ROS production by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) staining, and enzyme activity in the isolated CAFs. Analyzing the mitochondrial health of isolated CAFs provides a better understanding of the reverse Warburg effect and can also be applied to study the consequences of CAF mitochondrial changes, such as metabolic fluxes and the corresponding regulatory mechanisms on lung cancer heterogeneity. Thus, the present study advocates an understanding of tumor-stroma interactions on mitochondrial health. It would provide a platform to check mitochondrial-specific drug candidates for their efficacies against CAFs as potential therapeutics in the tumor microenvironment, thereby preventing CAF involvement in lung cancer progression.

Multicellular 3D tumor spheroids were prepared with lung adenocarcinoma cells, fibroblasts, and monocytes, followed by the isolation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) from these spheroids. Isolated CAFs were compared with normal fibroblasts to assess mitochondrial health by studying the mitochondrial transmembrane potential, reactive oxygen species, and enzymatic activities.

Bewertung der mitochondrialen Gesundheit in krebsassoziierten Fibroblasten, die aus 3D-multizellulären Lungentumor-Sphäroiden isoliert wurden

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Krebsforschung

Stabile Isotopenverfolgung und LC-MS-Analyse zur Messung von DHODH- und SDH-Aktivitäten

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Autor im Rampenlicht: Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Metabolische Mapping: Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie die Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben zu bestimmen

Zusammenfassung

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Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H₂ Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases

Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe

Ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern auf verschiedenen Skalen in neotropischen Anuren

Ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern auf verschiedenen Skalen in neotropischen Anuren

Bewertung der mitochondrialen Gesundheit in krebsassoziierten Fibroblasten, die aus 3D-multizellulären Lungentumor-Sphäroiden isoliert wurden

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren