Name: in vivo evaluation of fracture callus development during bone healing in mice using an mri-compatible osteosynthesis device for the mouse femur
Uploaded: 2017-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur at JoVE.com

Wir danken Sevil Essig, Stefanie Schroth, Verena Fischer, Katja Prystaz, Yvonne Hägele und Anne Subgang für ausgezeichneten technischen Support. Wir danken auch der Deutschen Forschungsgemeinschaft (CRC1149, INST40/499-1) und der AO Trauma Foundation Deutschland für die Finanzierung dieser Studie.

alle Tier Experimente internationale Regelungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingehalten und wurden von den regionalen Regulierungsbehörden (Nr. 1250, Regierungspräsidium Tübingen, Deutschland) genehmigt. Alle Mäuse waren gepflegt in Gruppen von zwei bis fünf Tiere pro Käfig auf einem 14 h Licht, 10 h dunkel zirkadianen Rhythmus mit Wasser und Nahrung zur Verfügung gestellt Ad Libitum.
 1. Vorbereitung der chirurgisches Material und Vorbehandlung der Mäuse <ol><li>alle chirurgischen Sterilisation Material. Verwenden Sie eine Autoklavierung Temperatur von 120-135 ° C für 20-30 min Sterilisation Zeit.</li>
	<li>Kauf C57BL/6 Mäusen oder Mäuse aus einem anderen Stamm, die zwischen 19-35 g Körpergewicht. Folgen Sie den entsprechenden Tierpflege und experimentelle Protokolle nach nationalen Richtlinien, die vom Prüfer zugelassen ist &#39; s institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss. Rechnen Sie mit mindestens 7 Tage Eingewöhnungszeit vor Beginn des Verfahrens.</li>
	<li>Bieten Analgesie für alle Mäuse über das Trinkwasser einen Tag vor der Operation bis zu dem dritten postoperativen Tag.</li>
</ol> 2. Chirurgische Verfahren und Anwendung der Fixateur externe <ol><li>statt die Maus in ein Rohr mit 5-7 % Isofluran und 60 mL/min Sauerstoff vorinstalliert. Entfernen Sie nach Verlust der posturalen Reflexe die Maus aus der Narkose Induktion Tube und Aufrechterhaltung der Narkose über eine Bereitstellung von 1-3 % Isofluran und 60 mL/min Sauerstoff Inhalationsmaske.
	<ol><li>Monitor die Atmung Muster und Hind Pfote Reflex während der Narkose. Sicherzustellen, dass die Atemfrequenz liegt bei rund 100 Zyklen/Min. und der Hinterpfote Reflex fehlt. 
		&#8203; Hinweis: die Menge des Gases notwendig ist abhängig von Alter, Geschlecht, Körpergewicht und Belastung der Maus.</li>
	</ol></li> <li>Vor der Operation, Spritzen die Maus subkutan mit einer Einzeldosis von Antibiotika (Clindamycin, 45 mg/kg). Darüber hinaus für die Aufrechterhaltung der physiologischen Flüssigkeitsbilanz, Spritzen die Maus mit einer subkutanen Flüssigkeit Depot 500 µL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).</li>
	<li>Hornhaut zu verhindern Trocknung, gelten Augensalbe für die Maus-Augen. Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte bei 37 ° C während der Narkose und chirurgischer Eingriff weiterhin physiologische Körpertemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fell aus der richtigen Hind Gliedmaßen und schrubben den OP-Bereich mit einem alkoholhaltigen Desinfektionsmittel. Abdecken der rechten Hinterpfote mit einem kleinen Teil eines sterilen Handschuh unsterilen Bereich zu vermeiden. Desinfizieren Sie die richtigen Hind Gliedmaßen dreimal. Legen Sie ein steriles Tuch über die ganze Maus mit Ausnahme der Operationsbereich.</li>
	<li>Einschneiden die Haut ca. 1 cm längs entlang der vorderen Seite des rechten Oberschenkel mit einem Skalpell. Trennen Sie unverblümt M. Biceps Femoris und M. Vastus Lateralis mit Mikro Scheren und Pinzetten. Schnittseite der Sehne Herkunft am Femur Trochanter mit einer Mikro Schere ermöglicht freien Zugang zu den anterolateralen Teil des Knochens. Stellen Sie sicher, dass der Ischiasnerv beibehalten wird.</li>
	<li>Position der Fixateur externe (axiale Steifigkeit von 3 N/mm, Abbildung 1 A) parallel zum Femur. Manuell Bohren Sie die durch Cortex mit einem 0,45-mm-Bohrer und legen Sie die Keramik Montage Stifte in die Bohrungen. Beginnen Sie mit die meisten proximalen Pin, gefolgt von der distalsten Pin und die beiden Stifte in-between.
	<ol><li>Stellen sicher, dass es keine Spannung, Kompression oder Schubspannung auf der Fixateur während der Montage-Verfahren, sonst wird die erreichte Osteotomie Lücke nicht durch Entspannung des Fixateurs ausreichen.</li>
	</ol></li> <li>Befeuchten die Knochen mit einer kleinen Menge des sterilen NaCl um Dehydrierung bei der Sägen zu vermeiden.</li>
	<li>Erstellen eine 0,4-mm-Osteotomie durch den gesamten Knochen zwischen den beiden inneren Pins mit einem 0,4 mm Gigli Seilsäge. 
	Hinweis: Optional kann eine oszillierende Mikro-Säge verwendet werden um die Osteotomie zu erstellen. Achten Sie darauf, Metallspäne von der Säge im Bereich Osteotomie zu vermeiden.</li>
	<li>Spülen die Osteotomie Lücke vorsichtig mit 2 mL sterile NaCl Knochenchips zwischen zwei gebrochenen Cortex entfernen.</li>
	<li>Anpassung der Muskeln durch die Verwendung einer kontinuierlichen Naht mit einer resorbierbaren Naht (siehe Tabelle der Materialien). Passen Sie dann die Haut mithilfe von unterbrochenen nicht resorbierbaren Fäden (siehe Tabelle der Materialien). Um zu vermeiden, Wunde zu beißen, stellen Sie nicht die Naht am kranialen Teil der Wunde. 
	Hinweis: Verwenden Sie nicht Hautkleber oder Clips da Mäuse in der Regel es aus der Wunde verursachen entfernen weitere Schäden an der Haut.</li>
	<li>Der OP-Bereich mit einem Desinfektionsmittel zu reinigen und platzieren Sie den Mauszeiger in seinen Käfig. Monitor Maus und Versorgung ausreichend Wärme (z.B. durch Infrarot-Licht) bis es vollständig wach ist. Wasser, Nahrungsaufnahme und Körpergewicht nach der Operation zu überwachen Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht in Schmerz und Leid ist. Alle Mäuse über das Trinkwasser erst am dritten postoperativen Analgesie gewähren. 
	Hinweis: Mäuse können in Gruppen von bis zu vier Tiere untergebracht werden.</li>
	<li>Überwachen die Maus &#39; s Aktivität auf 1 bis 5 Tage nach der Operation. Im Laufe dieser Zeit sollte die Maus auf der operierten Extremität tragen. Andernfalls muss die Maus von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.</li>
</ol> 3. MRT-Verfahren und Bildanalyse <ol><li>vor der MRI Scan-Verfahren, betäuben die Maus nach dem Protokoll in Schritte 2.1 und 2.3, und halten Sie die Atemfrequenz rund 100 Zyklen/min. der Fixateur externe an das richtige Hind Glied des Einfügen der Maus vorsichtig in eine maßgefertigte Halterung ( Abbildung 1 B, C).
	<ol><li>Achten Sie darauf, verbiegen oder Kompression des Fixateurs während dieses Schrittes zu vermeiden, da dies Frakturheilung behindern kann. 
		Hinweis: Die MRT-Untersuchungen durchgeführt werden so früh wie 3 Tage nach der Operation, abhängig von der Pflege der Tiere und experimentelles Protokoll.</li>
	</ol></li> <li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine temperaturgeregelte Wiege für Einführung in das MRT-Gerät. Anbringen der Halterung starr an der vier-Elemente-Kopf Spule.</li>
	<li>Erwerben MRT-Daten über eine dedizierte Hochfeld-klein-Tier-MRT-System mit 11,7 T. 
	&#8203; Hinweis: die MRI Daten Erwerb Geometrie orientiert sich mit dem Oberschenkelknochen, orthogonal zu den Schrauben.
	<ol><li>Erfassen Daten durch die Anwendung einer Proton-Dichte Fett unterdrückt Mehrschicht TSE Sequenz (PD-TSE) mit Aufnahmeparameter: Echo/Wiederholung Zeit TE = 5,8 ms/TR = 2.500 ms, Auflösung Δr = 52 × 52 × 350 µm³, Field of View (FOV) = 20 × 20 mm ² und Bandbreite Δω = 150 KHz.</li>
		<li>Hinweis: die gesamte Akquisition 22 Scheiben dauert 36 min.</li>
	</ol></li> <li>Die erfassten Daten mit Bildanalyse-Software zu öffnen. Geben Sie die Voxel-Größe als 0,05 x 0,05 x 0,35 mm 3. Die verschiedenen Geweben in der Fraktur Kallus (Knochen, Knorpel, faserigen Gewebe/Knochenmark) anhand ihrer Intensität mit halbautomatischen Schnittstellenüberwachung wie folgt zu segmentieren.
	<ol><li>Klicken Sie auf die &#34; neue Label-Feld bearbeiten &#34;, klicken Sie &#34; hinzufügen Material &#34;, und benennen Sie das Material zur &#34; Kallus &#34;. Das umliegende Gewebe, basierend auf der Hypo-intensiven Signal aus dem Periost mit Kallus Bereich unterscheiden die &#34; Lasso &#34; Tool.</li>
		<li>Klicken Sie &#34; Material hinzufügen &#34;. Klicken Sie &#34; hinzufügen Material &#34; und benennen Sie das Material zur &#34; Knorpel &#34;. Segment den Knorpel durch die Verwendung der &#34; Schwelle &#34; Werkzeug und &#34; wählen Sie nur aktuelle Material &#34; aus &#34; Kallus &#34;. Klicken Sie &#34; Knorpel &#34; und &#34; Material hinzufügen &#34;. Wiederholen Sie diese Schritte mit &#34; Knochen &#34; und &#34; Knochenmark/Bindegewebe &#34;.</li>
	</ol></li> <li>3D-Rekonstruktionen der gebrochenen Oberschenkelknochen, basierend auf dem Gewebe Segmentierungsdaten mit Bildanalyse-Software zu generieren. Klicken Sie &#34; erzeugen Oberfläche &#34;, gelten &#34; keine &#34; für &#34; glätten Typ &#34; und klicken Sie auf &#34; Oberfläche Ansicht &#34;. 
	Hinweis: Sehr klein, hyper-intensive Bereiche rund um die EnDS der gebrochenen Cortex dürften Artefakte aufgrund des Übergangs von knöchernen, weiches Gewebe. Diese Bereiche sollten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Hyper-intensive Bereiche in der Mitte der Fraktur Kallus in der Endochondral Phase der Frakturheilung knorpelige Gewebe darstellen. Hypo-intensiv bei der Fraktur distale Kallus aus der Osteotomie Lücke in der Phase der Endochondral Verknöcherung und Bereichen mit der gleichen Intensität während der ganze Bruch Kallus bei später Heilung Stadien vertreten neu gebildeten knöchernen Kallus Gewebe. Obwohl diese Bereiche ein Hypo-intensiven Signal haben, ist die Signalintensität aus reifen Knochen (Kortex) sogar noch niedriger. Markieren Sie nach Schwellwerte die Signalintensität für Knochengewebe und knorpeligen Gewebe in der Fraktur Kallus das restliche Gewebe wie Knochenmark und Bindegewebe. Werte für Gewebe Segmentierung sind: Knochengewebe (einschließlich Reife Cortex, trabekulären Knochen und Gewebe knöchernen Kallus) ist im Bereich von 1-3.3 (normalisierte Signalintensität Reife Kortex), Knochenmark/Bindegewebe im Bereich von 3,4-5,4, segmentiert und knorpelige Kallus Gewebe im Bereich von 5,5-6,2.</li>
	<li>Wiederholen Sie bei Bedarf die MRT-Untersuchung längs während der Frakturheilung Prozess. Knorpelige Kallus Entwicklung zu verfolgen, die Mäuse auf 10, 14 und 21 Tage nach der Operation zu scannen. 
	Hinweis: Die Zeitpunkte können hängen von der Pflege der Tiere und experimentelles Protokoll.</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoPET/MR+imaging+allows+specific+detection+of+Aspergillus+fumigatus+lung+infection+in+vivo.">ImmunoPET/MR imaging allows specific detection of Aspergillus fumigatus lung infection in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 1026-1033 (2016).</li><li>Niemeyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+tracking+of+human+haemopoietic+CD34(+)+stem+cells+in+vivo+in+immunodeficient+mice+by+using+magnetic+resonance+imaging.">Non-invasive tracking of human haemopoietic CD34(+) stem cells in vivo in immunodeficient mice by using magnetic resonance imaging.</a> Eur Radiol. 20 (9), 2184-2193 (2010).</li></ol>

Der Autor Romano Matthys ist Angestellter der RISystem AG Davos, Schweiz, die produziert die Implantate und Implantat-spezifische Instrumente, die in diesem Artikel verwendet. Andere Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Modifikationen und Fehlerbehebung:
Das Hauptziel dieser Studie war es, ein Protokoll für die Verwendung von einem MRI-kompatible externe Fixateur für Femur Osteotomie in der Maus mit der Fähigkeit, Kallus Gewebeentwicklung längs während des Endochondral Frakturheilung Prozesses überwachen zu beschreiben. Das Design der eine maßgeschneiderte Halterung zum Einschieben der Fixateur externe gewährleistet eine einheitliche Position während der wiederholten Scans. Halbautom...

Sekundäre Frakturheilung ist die häufigste Form der Knochenheilung. Es ist ein komplexer Prozess imitiert bestimmte Aspekte von ontogenic Endochondral Verknöcherung1,2,3. Die frühen Fraktur Hämatom besteht überwiegend aus Immunzellen, Granulierung und Bindegewebe. Wenig Sauerstoff Spannung und biomechanischen Hochstämme Osteoblasten Differenzierung bei den Frakturspalt behindern, sondern fördern die Differenzierung von Vorläuferzellen in Chondrozyten4,5,6. Diese Zellen beginnen sich zu vermehren sich an der Stelle der Verletzung eine knorpelige Matrix bietet Primärstabilität des gebrochenen Knochens zu bilden. Während der Reifung der Kallus, Chondrozyten, hypertrophe, werden unterziehen Apoptose oder Trans-Osteoblasten differenzieren. Neovaskularisation bei der Knorpel-Knochen-Übergangszone bietet erhöhten Sauerstoffgehalt, die Bildung von Knochengewebe7ermöglicht. Nach knöcherne Überbrückung der Frakturspalt, biomechanische Stabilität erhöht und osteoclastic Umbau der externen Fraktur Kallus auftritt, um physiologische Knochen Kontur und Struktur3zu gewinnen. Daher liefern die Mengen von faserigen, knorpeligen und knöchernen Gewebe in der Fraktur Kallus wichtige Informationen über die Knochenheilung Prozess. Gestörte oder verzögerte Heilung wird sichtbar durch Veränderungen der Hornhaut Gewebeentwicklung sowohl bei Menschen und Mäusen8,9,10,11. Verfügbar in Vivo Techniken zur Längsrichtung Kallus Gewebeentwicklung in präklinischen Studien mit kleinen Tieren der Frakturheilung überwachen gehören digitale Radiographie und µCT imaging-12,13. Beide Techniken sind jedoch nur in der Lage, zwischen mineralisierten und nicht mineralisierten Gewebe zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu MRT bietet ausgezeichneten Weichgewebe Kontrast und kann daher möglicherweise Weichgewebe und Knorpel in der Fraktur Kallus zu identifizieren.
Bisherige Arbeit zeigte vielversprechende Ergebnisse für Postmortem MRI bei Mäusen mit14 und in Vivo MRT artikuläre Frakturen bei Mäusen während intramembranous Knochendefekt heilende15. Beide Studien gaben auch begrenzte räumliche Auflösung und Gewebe-Kontrast. Wir zeigten zuvor die Machbarkeit der hochauflösenden in Vivo MRT für längs-Beurteilung der weichen Kallus-Bildung während der murinen Endochondral Frakturheilung16. Hier berichten wir über das Protokoll für die Verwendung eines MRI-kompatible externe Fixateur für Femur Osteotomie bei Mäusen um Kallus Gewebeentwicklung längs während der Endochondral Frakturheilung Prozess zu überwachen. Das Design der eine maßgeschneiderte Halterung zum Einschieben der Fixateur externe gewährleistet eine einheitliche Position während der wiederholten Scans.

<table><tbody><tr><td>Anaesthesia tube</td><td>FMI, Seeheim, Germany</td><td>ZUA-82-ANA-TUB-Mouse</td><td></td></tr><tr><td>Anaesthetic machine&amp;nbsp;</td><td>FMI, Seeheim, Germany</td><td>ZUA-82-GME-MA</td><td></td></tr><tr><td>Artery forceps&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BH104R</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec, Wettenberg, Germany</td><td>DX-150</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaving packaging</td><td>Stericlin, Feuchtwangen, Germany</td><td>2301-04/06/10/12/16</td><td></td></tr><tr><td>Avizo software</td><td>FEI, Burlington, USA</td><td>-</td><td>Version 8.0.1</td></tr><tr><td>BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system</td><td>Bruker Biospin, Ettlingen, Germany</td><td>117/16</td><td></td></tr><tr><td>Bulldog clamp&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BH 021R</td><td></td></tr><tr><td>Carbon steel scalpel no. 11/15</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BA211/215</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic mounting pin 0.45 mm&amp;nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>HS691490</td><td></td></tr><tr><td>Clindamycin (300 mg / 2ml)</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dressing forceps 115 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BD210R</td><td></td></tr><tr><td>Dressing forceps 130 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BD025R</td><td></td></tr><tr><td>Drill bit coated 0.45 mm&amp;nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>HS820420</td><td></td></tr><tr><td>Durogrip needle holder 125 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BM024R</td><td></td></tr><tr><td>Foliodrape&amp;nbsp;</td><td>Hartmann, Heidenheim, Germany</td><td>2513026</td><td></td></tr><tr><td>Frekaderm</td><td>Fresenius, Bad Homburg, Germany</td><td>4928211</td><td></td></tr><tr><td>Gigli saw 0.44 mm&amp;nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>RIS.590.110.25</td><td></td></tr><tr><td>Hand drill</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>RIS.390.130-01</td><td></td></tr><tr><td>Heating plate&amp;nbsp;</td><td>FMI, Seeheim, Germany</td><td>IOW-3704</td><td></td></tr><tr><td>Hygonorm gloves&amp;nbsp;</td><td>Hygi, Telgte, Germany</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot, London, UK</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>Micro forceps 155 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BD343R</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors 120 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>FD013R</td><td></td></tr><tr><td>Mouse FixEx L 0.7 mm&amp;nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>RIS.611.300-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle case for drills&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BL911R</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BB078R</td><td></td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&amp;uuml;lke, Norderstedt, Germany</td><td>121403</td><td></td></tr><tr><td>Osirix software</td><td>Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland</td><td>-</td><td>Version 4.0</td></tr><tr><td>Oxygen, medical grade</td><td>MTI, Ulm, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Resolon 5/0</td><td>Resorba, N&amp;uuml;rnberg, Germany</td><td>88143</td><td></td></tr><tr><td>Saline 0.9%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>3570350</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle 125 mm</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>Scissors 150 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BC006R</td><td></td></tr><tr><td>Sealer for autoclave packaging&amp;nbsp;</td><td>Hawo GmbH, Obrigheim, Germany</td><td>HM500</td><td></td></tr><tr><td>Sterican 27 G&amp;nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical blades no. 11/15&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BB511/515</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves&amp;nbsp;</td><td>Hartmann, Heidenheim, Germany</td><td>Peha-micron 9425712</td><td></td></tr><tr><td>Surgical light&amp;nbsp;</td><td>Maquet SA, Ardon, France</td><td>Blue line 80</td><td></td></tr><tr><td>Syringes 5 ml&amp;nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>Injekt 4606051V</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps 80 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>OC091R</td><td></td></tr><tr><td>Tramadol 25 mg/l</td><td>Gr&amp;uuml;nenthal, Aachen, Germany</td><td>100mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Vasofix Safety&amp;nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4268113S-01</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 5-0&amp;nbsp;</td><td>Ethicon, Norderstedt, Germany</td><td>V30371</td><td></td></tr><tr><td>Visdisic eye ointment&amp;nbsp;</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb, Berlin, Germany</td><td>3099559</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of fracture callus development during bone healing in mice using an mri-compatible osteosynthesis device for the mouse femur

Endochondral Frakturheilung ist ein komplexer Prozess mit der Entwicklung von faserigen, knorpeligen und knöchernen Gewebe in der Fraktur Kallus. Die Menge der verschiedenen Gewebe in der Kallus liefert wichtige Informationen über den Fortschritt der Frakturheilung. Verfügbar in Vivo Techniken, längs der Kallus Gewebeentwicklung in präklinischen Frakturheilung Studien mit kleinen Tieren zu überwachen sind digitale Radiographie und µCT-Bildgebung. Beide Techniken sind jedoch nur in der Lage, zwischen mineralisierten und nicht mineralisierten Gewebe zu unterscheiden. Infolgedessen ist es unmöglich, Knorpel aus fibrösem Gewebe zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) anatomische Strukturen anhand des Wassergehaltes visualisiert und können daher möglicherweise nicht-invasiv Weichgewebe und Knorpel in der Fraktur Kallus zu identifizieren. Hier berichten wir über die Verwendung von ein MRI-kompatiblen Fixateur externe für die Maus Femur, MRI-Scans während Knochenregeneration bei Mäusen zu ermöglichen. Die Experimente zeigten, dass der Fixateur und eine maßgeschneiderte Montagevorrichtung repetitive MRT-Untersuchungen erlauben damit Längsschnittanalyse von Fraktur-Kallus Gewebeentwicklung.

Erstens kann der Erfolg des chirurgischen Eingriffs durch Analyse von MRT-Untersuchungen bestätigt werden (siehe Beispiel in Abbildung 2). Alle vier Pins sollte in der Mitte der femoral Welle befinden. Die Größe der Lücke Osteotomie sollte zwischen 0,3-0,5 mm. Wenn die Größe der Osteotomie Lücke stark von diesen Werten variiert, sollte die Maus von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
Zweiten...

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In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Bewertung der Fraktur Kallus Entwicklung während der Knochenheilung bei Mäusen mit einem MRI-kompatiblen Osteosynthese Gerät für Maus Femur

Die Auswertung der Gewebeentwicklung in Fraktur Kallus während Endochondral Knochenheilung ist wichtig, den Heilungsprozess überwachen. Wir berichten hier, die Verwendung von einer Magnetresonanztomographie (MRT)-kompatibel Fixateur externe für die Maus Femur erlauben MRI scans während Knochenregeneration bei Mäusen.

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

in-vivo-evaluation-fracture-callus-development-during-bone-healing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

9.5K Aufrufe.  University Medical Center Ulm. Die Auswertung der Gewebeentwicklung in Fraktur Kallus während Endochondral Knochenheilung ist wichtig, den Heilungsprozess überwachen. Wir berichten hier, die Verwendung von einer Magnetresonanztomographie (MRT)-kompatibel Fixateur externe für die Maus Femur erlauben MRI scans während Knochenregeneration bei Mäusen.

Serie: In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Forschung

Medizin

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Einrichtung eines segmentalen Femoral Critical-size Defektmodell in Mäusen durch Plattenosteosynthese Stabilisierte

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice

Bone healing models are essential to the development of new therapeutic strategies for clinical fracture treatment. Furthermore, mouse models are becoming more commonly used in trauma research. They offer a large number of mutant strains and antibodies for the analysis of the molecular mechanisms behind the highly differentiated process of bone healing. To control the biomechanical environment, standardized and well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory in mice. Here, we report on the design and use of an intramedullary nail to stabilize open femur osteotomies in mice. The nail, made of medical-grade stainless steel, provides high axial and rotational stiffness. The implant further allows the creation of defined, constant osteotomy gap sizes from 0.00 mm to 2.00 mm. Intramedullary locking nail stabilization of femur osteotomies with gap sizes of 0.00 mm and 0.25 mm result in adequate bone healing through endochondral and intramembranous ossification. Stabilization of femur osteotomies with a gap size of 2.00 mm results in atrophic non-union. Thus, the intramedullary locking nail can be used in healing and non-healing models. A further advantage of the use of the nail compared to other open bone healing models is the possibility to adequately fix bone substitutes and scaffolds in order to study the process of osseous integration. A disadvantage of the use of the intramedullary nail is the more invasive surgical procedure, inherent to all open procedures compared to closed models. A further disadvantage may be the induction of some damage to the intramedullary cavity, inherent to all intramedullary stabilization techniques compared to extramedullary stabilization procedures.

This protocol describes an osteosynthesis technique using an intramedullary locking nail for standardized fixation of femur osteotomies, which can be used to analyze normal and defective bone healing in mice.

Eine intramedulläre Verriegelungsnagel für Standardisierte Fixierung von Femur Osteotomien zur Analyse von normalen und Defekte Knochenheilung bei Mäusen

Bone healing models are essential to the development of new therapeutic strategies for clinical fracture treatment. Furthermore, mouse models are becoming ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Eine Minimal-Invasive Modell Endochondral Frakturheilung bei Mäusen unter standardisierten Bedingungen biomechanische Analyse

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

Die Generation der geschlossenen femoralen Frakturen bei Mäusen: ein Modell zur Knochenheilung

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

Protocol for Developing a Femur Osteotomy Model in Wistar Albino Rats

Fracture healing is a physiological process resulting in the regeneration of bone defects by the coordinated action of osteoblasts and osteoclasts. Osteoanabolic drugs have the potential to augment the repair of fractures but have constraints like high costs or undesirable side effects. The bone healing potential of a drug can initially be determined by in vitro studies, but in vivo studies are needed for the final proof of concept. Our objective was to develop a femur osteotomy rodent model that could help researchers understand the development of callus formation following fracture of the shaft of the femur and that could help establish whether a potential drug has bone healing properties. Adult male Wistar albino rats were used after Institutional Animal Ethics Committee clearance. The rodents were anesthetized, and under aseptic conditions, complete transverse fractures at the middle one-third of the shafts of the femurs were created using open osteotomy. The fractures were reduced and internally fixed using intramedullary K-wires, and secondary fracture healing was allowed to take place. After surgery, intraperitoneal analgesics and antibiotics were given for 5 days. Sequential weekly x-rays assessed callus formation. The rats were sacrificed based on radiologically pre-determined time points, and the development of the fracture callus was analyzed radiologically and using immunohistochemistry.

Here, we present a protocol to iatrogenically fracture the shaft of the femur of Wistar albino rats and follow up on the development of the callus. This femur osteotomy model can help researchers evaluate the process of fracture healing and to study how a drug could influence fracture healing.

Protokoll zur Entwicklung eines Femurosteotomiemodells bei Wistar Albino-Ratten

Fracture healing is a physiological process resulting in the regeneration of bone defects by the coordinated action of osteoblasts and osteoclasts. ...

Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test whether a gene, gene product or drug influences bone repair because murine bones recapitulate the stages observed during human fracture healing. When a mouse or human breaks a bone, an inflammatory response is initiated, and the periosteum, a stem cell niche surrounding the bone itself, is activated and expands. Cells residing in the periosteum then differentiate to form a vascularized soft callus. The transition from the soft callus to a hard callus occurs as the recruited skeletal progenitor cells differentiate into mineralizing cells, and the bridging of the fractured ends results in the bone union. The mineralized callus then undergoes remodeling to restore the original shape and structure of the healed bone. Fracture healing has been studied in mice using various injury models. Still, the best way to recapitulate this entire biological process is to break through the cross-section of a long bone that encompasses both cortices. This protocol describes how a stabilized, transverse femur fracture can be safely performed to assess healing in adult mice. A surgical protocol including detailed harvesting and imaging techniques to characterize the different stages of fracture healing is also provided.

This protocol describes a method to perform fractures on adult mice and monitor the healing process.

Querbruch des Mausfemurs mit stabilisierendem Stift

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

Biologie

Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography

Micro-computed tomography (&#181;CT) is the most common imaging modality to characterize the three-dimensional (3D) morphology of bone and newly formed bone during fracture healing in translational science investigations. Studies of long bone fracture healing in rodents typically involve secondary healing and the formation of a mineralized callus. The shape of the callus formed and the density of the newly formed bone may vary substantially between timepoints and treatments. Whereas standard methodologies for quantifying parameters of intact cortical and trabecular bone are widely used and embedded in commercially available software, there is a lack of consensus on procedures for analyzing the healing callus. The purpose of this work is to describe a standardized protocol that quantitates bone volume fraction and callus mineral density in the healing callus. The protocol describes different parameters that should be considered during imaging and analysis, including sample alignment during imaging, the size of the volume of interest, and the number of slices that are contoured to define the callus.

Micro-computed tomography (&#181;CT) is a non-destructive imaging tool that is instrumental in assessing bone structure in preclinical studies, however there is a lack of consensus on &#181;CT procedures for analyzing the bone healing callus. This study provides a step-by-step &#181;CT protocol that allows the monitoring of fracture healing.

Beurteilung der Knochenbruchheilung mittels Mikro-Computertomographie

Micro-computed tomography (&#181;CT) is the most common imaging modality to characterize the three-dimensional (3D) morphology of bone and newly formed ...

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

Etablierung eines diaphysären Femurfrakturmodells bei Mäusen

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...

In Vivo Bewertung der Fraktur Kallus Entwicklung während der Knochenheilung bei Mäusen mit einem MRI-kompatiblen Osteosynthese Gerät für Maus Femur

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