Teile dieser Studie wurden freundlicherweise unterstützt durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).

Hinweis: Eine Übersicht über die allgemeine experimentelle Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.
Achtung: RTA ist sehr giftig für den Menschen. Sicherheit Labor Erlaubnis S2 (Biosafety level 2 Äquivalent) ist erforderlich. Bitte tragen Sie Handschuhe während des gesamten Experiments.
(1) heterologen Expression von sein-tagged RTA in Escherichia coli
<ol>
	<li>E. Coli Zellen mit Ausdruck Plasmid pET24-RTA(His) 6 oder leerer Vektor pET24a(+) mit standard Elektroporation Protokolle9,10zu verwandeln. Zellen mit dem leeren Plasmid dienen als Negativkontrolle.</li>
	<li>Nach Auswahl des positiven Klone auf Kanamycin-haltigen (100 µg/mL) LB-Platten Zellen, in denen das RTA-Expressionsplasmid oder der leere Vektor in 5 mL LBkan Medium (LB-Medium mit 100 µg/mL Kanamycin) zu impfen und Inkubation bei 37 ° C und 220 u/min für 24 h.</li>
	<li>Ergänzen Sie 1 L LBkan Medium mit 5 mL Vorkultur zu und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 220 u/min bis Zellen eines OD600 von 0,8-1,0 (ca. 3-4 h) erreicht haben. Danach reduzieren Sie Kultur Temperatur 28 ° c und bereiten Sie eine 1 M Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) Stammlösung in H2O.</li>
	<li>RTA-Ausdruck von E. Coli durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zu induzieren.</li>
	<li>Waschen Sie nach 3,5 h bei 28 ° C und 220 u/min, Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 min das Pellet zweimal mit 5 mL Bindung Puffer (500 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 20 mM KH2PO4 pH = 7,4) bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 min und Aufschwemmen Pellet in 5 mL Bindung Puffer. Hinweis: Protokoll kann in dieser Phase angehalten werden und Zellen können für mehrere Tage bei 80 ° C gelagert werden.</li>
</ol>
2. Reinigung des sein-tagged RTA über Affinitätschromatographie
<ol>
	<li>Beschallen Sie Zellen auf Eis mit das folgende Protokoll: 15 s-Pulse (20 Mikron), 30 s Pause. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Zelle lysate auf 21.000 x g und 4 ° C für 15 min und Filtern Sie überstand eine sterile Spritze-Filter-System (0,2 µm Porengröße) verwenden. Hinweis: Zelle Pellets erfolgreich beschallten Proben zeigen transparente Ränder.</li>
	<li>Verwenden Sie ein automatisches Reinigungssystem ausgestattet mit einer 5 mL Ni2 +-basierte Affinität Spalte um die sein-tagged RTA-Fraktion aus der steril filtriert E. Coli überstand zu reinigen. Im Allgemeinen verwenden Sie eine Elution Geschwindigkeit von 1 mL/min und kühl das ganze Reinigungssystem zur Vermeidung von nicht-effiziente Toxin Bindung und Verlust der Toxin-Aktivität. Hinweis: Parameter für die effiziente Reinigung der RTA sind in Tabelle 1aufgeführt. Siehe auch Becker Et Al. für weitere Informationen9.<ol>
		<li>Kurz, equilibrate der Affinität Spalte mit 20 mL Bindung Puffer, Speicher-Puffer zu entfernen. Wenden Sie steril filtriert Überstand auf die Affinität Säule mit einer Spritze.</li>
		<li>Waschen Sie die Spalte mit 25-35 mL Bindung Puffer, die ungebundenen Proteine aus der Spalte zu entfernen. Führen Sie den Waschschritt bis UV-Absorption bei 280 nm liegt in der Nähe der UV-Anfangswert.</li>
		<li>Eluieren gebundene RTA Bruchteil in 20-35 mL Elution Buffer (500 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7,2) und halten Sie die Probe auf Eis (Abb. 2A und 2 b). Hinweis: Elution der RTA-Fraktion zeichnet sich durch eine Zunahme der UV-Absorption. Hinweis: um diese Fraktion zur Vermeidung von Kontamination mit unspezifischen gebundene Proteine ausschließlich zu sammeln.</li>
		<li>Verwenden Sie 20 µL des eluierten Proben Coomassie blaue Färbung11 oder Western-Blot Analyse12,13 (Optional) durchführen. Verwenden Sie primär Anti-His Antikörper (1:1 000) und sekundären anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) zur Erkennung von RTA und überprüfen Probe Reinheit (Abbildung 3).</li>
		<li>Entsalzen eluierten RTA Bruchteil einer 5 mL Entsalzung Spalte und equilibrate Probe in 0,8 M Sorbit.<ol>
			<li>Ersetzen der Affinität Spalte das Reinigungssystem der Entsalzung spaltenweise und equilibrate zuerst die Spalte mit 20 mL 0,8 M Sorbit.</li>
			<li>Wenden Sie den eluierten RTA-Bruch in die Spalte über eine Spritze an. Waschen Sie die Spalte mit 100 mL 0,8 M Sorbit und eluieren Sie entsalzten RTA-Bruch in der 15 mL Tube, sobald die UV-Absorption beginnt zu erhöhen (Abbildung 2).</li>
			<li>Speichern Sie den eluierten RTA-Bruch bei 4 ° C. Hinweis: Hören Sie RTA Bruchteil Probenahme direkt auf, wenn Leitfähigkeit steigt auf um Salz Kontamination zu vermeiden. Parameter für die Entsalzung Verfahren sind in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluierten RTA Bruchteil bei 10.000 x g und 4 ° C für 30-180 min mit einer 10 kDa Cutoff Spin Spalte zu einem Endvolumen von ca. 1-2 mL zu konzentrieren und Probe bei 4 ° C für 3-4 Wochen aufbewahren. Achtung: Nicht Einfrieren der Probenmaterials seit Einfrieren führt zu einem vollständigen Verlust des RTA-Aktivität.</li>
	<li>Proteinkonzentration mit einem konventionellen Protein Entschlossenheit-Kit zu bestimmen. Proteinkonzentration sollte im Bereich von 1-1,5 mg/mL sein. Hinweis: RTA tendenziell herbeiführen, wenn die Proteinkonzentration zu hoch ist (&#62; 5 mg/mL).</li>
</ol>
3. Hefe-Transformation und Zellwand entfernen
<ol>
	<li>Wildtyp oder ausgewählte Hefe Löschung Mutanten mit der GFP Reporter Plasmid pRS315-K28SP- GLP6 mit standard-Lithium-Acetat Umwandlung Methoden14zu verwandeln. Inkubieren Sie Zellen auf Leucin Drop-out (d/o) Glukose-Platten (2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % Hefe Stickstoff Basis (YNB) und 0,087 % d/o Mix ohne Leucin) bei 30 ° C für ca. 2-3 Tage für positive Klon-Auswahl.</li>
	<li>Wählen Sie 3 verschiedene Hefe Klone von jeder Platte und impfen die Klone in 100 mL Leucin d/o Raffinose Medium (2 % Raffinose, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % d/o ohne Leucin mix) bei 220 u/min und 30 ° C bis OD600 = 1,0-2,0 (2-4 x 107 Zellen/mL). Hinweis: Zellwachstum von den verschiedenen Hefestämme Löschung unterscheidet. Monitor OD600 über einem Spektrophotometer.</li>
	<li>Um600 OD-Werte zu berechnen, verdünnen Sie Proben auf OD600 = 0,1-0,3 (1:5 bis 01:10 Verdünnungen) und OD600 in einem Spektrophotometer zu messen. Als Referenz verwenden Sie H2O, ergänzt mit der entsprechenden Menge an Leucin d/o Raffionose Medium.</li></ol>Zu guter Letzt Aufschwemmen OD600 = 125 in 5 mL sterilem Wasser (5 x 108 Zellen/mL).
	<li>Zellen bei 25 ° C für 5 min bei 10.000 x g Zentrifugieren und waschen Zellen zweimal mit 5 mL sterilem Wasser Aufschwemmen Zellen in 50 mL Spheroplasting Puffer (0,8 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl2, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 200 µg/mL lytische Enzym).</li>
	<li>Inkubieren Sie die 50 mL-Kultur bei 100 u/min und 30 ° C für 90 min. Optional: Spheroplast Bildung alle 15 min von Phasenkontrastmikroskopie zu überwachen. Unter dem Mikroskop sollte Zellen eine transluzente dunkelgraue Farbe haben. Bright (strahlenbrechende) Zellen sind nur unzureichend verdaut, während Geister (hellgrau Zellen mit wenig, wenn überhaupt, interne Struktur) over verdaut.</li>
	<li>Spheroplast Vorbereitung Wirksamkeit für jede Probe zu überprüfen.
	<ol>
		<li>Nach Fertigstellung Schritt 3.5, 4 µL der spheroplasted 50 mL Kultur mit 496 µL Spheroplasting-Puffer (ca. 2 × 106 Spheroplasts) mischen und für 10 min bei 400 X g zentrifugieren.</li>
		<li>Aufschwemmen Pellet in 10 mL H2O destilliert, Vortex Probe für 30 s und Platte aus 10 µL der Probe auf Leucin d/o Glukose Platten (2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % d/o Mix ohne Leucin).</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen für 3 Tage bei 30 ° c Zählen Sie die Gesamtzahl der Erwachsenen Zelle Kolonien auf der Platte. Zur Datenauswertung, verwenden nur Proben mit mehr als 98 % Wirkungsgrad (Gesamt Kolonie Handynummer &#60; 40 Kolonien/Platte).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Zellen aus Schritt 3.5 bei 400 x g und 4 ° C für 10 min und waschen Zellen zweimal mit 5 mL stabilisiert Leucin d/o Raffinose Medium (0,8 M Sorbit, 2 % Raffinose, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % Drop-out-Mix ohne Leucin). Aufschwemmen Sie Zellen in 5 mL stabilisierte Leucin d/o Raffinose Medium (1 x 108 Zellen/mL) und verwenden Sie Zellen für die GFP Reporter Assay Messungen (Abschnitt 4) direkt zu.</li>

(4) GLP Reporter Assay Messung in 96-Well-Platten
<ol>
	<li>Samen aus der Hefe Zelle Spheroplasts in Schritt 3,7 in 96-Well-Platten (200 µL/Well) erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 70 µL stabilisierte Leucin d/o Raffinose-haltigem Medium Negativkontrolle (Eluat eines Ni2 +-Affinität gereinigten Zelle lysate aus IPTG induziert E. Coli Zellen mit dem Ausdruck des leere Vektors) oder RTA in einer Endkonzentration von RTA von 5 µM (gereinigt entsprechend 160 g/L RTA) in jede Vertiefung.</li>
	<li>Fügen Sie sofort 30 µL stabilisiert Galaktose Lösung (30 % Galaktose, 0,8 M Sorbit) induzieren GFP Ausdruck und anschließend starten Sie die Messung. Hinweis: Führen Sie mindestens 3 Technische Wiederholungen pro Experiment und 3 biologische repliziert pro Hefestamm.</li>
	<li>Nach Abschluss der Probenvorbereitung (Schritte 4.1-4.3), die 96-Well-Platte in einem Fluoreszenz-Reader setzen und starten Sie die Messung. Verwenden Sie die 475/509 nm Filtersatz für GLP-Fluoreszenz-Detektion erforderlich. Messungen Sie bei 30 ° C, 120 u/min, und mit einem schütteln Durchmesser von 1 mm über ein Zeitfenster von 20 h (Messung von Abständen von 10 min). Hinweis: Die GLP-Filter-Set gibt es normalerweise in alle Lesesysteme. Temperatur, Zeitfenster, Messung von Abständen und RTA-Konzentration kann für die eigenen Bedürfnisse angepasst werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt.</li>
	<li>Optional: Verwenden Sie zusätzliche interne Kontrollen bei der Messung für die Qualitätskontrolle. Bereiten Sie eine Negativkontrolle durch Zugabe von 30 µL stabilisierte Leucin d/o Raffinose Medium anstatt 30 % Galaktose (keine GFP Induktion). Darüber hinaus fügen Sie 70 µL 0,8 M Sorbit stabilisiert G418 Lösung (300 µg/mL). Die Protein-Übersetzung-Inhibitor G418 dient als Positivkontrolle für Protein-Hemmung wie GFP Ausdruck in der Hefe verhindert.</li>
	<li>Relative GFP-Fluoreszenz in Prozent für die 20 h-Zeitpunkt nach der folgenden Gleichung berechnen (siehe Abb. 4A): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> wo NC ist die negativ-Kontrolle
	<ol>
		<li>Alternativ, bestimmen die relativen GFP Fluoreszenz für jeden Meßpunkt (in diesem Fall 10 min, siehe auch Schritt 4.4) unter Verwendung der obigen Gleichung. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, erstellen Sie ein Diagramm, indem die GFP-Fluoreszenz-Intensitäten (y-Achse) im Laufe der Zeit (x-Achse) beflecken.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum.">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li><li>Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+entry+of+Shiga-like+toxin+a+chain+from+the+yeast+endoplasmic+reticulum+requires+catalytically+active+Hrd1p.">Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p.</a> PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).</li><li>Moreau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screens+identify+genes+required+for+Ricin+and+PE+intoxications.">Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications.</a> Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+an+external+Lys-Asp-Glu-Leu+(KDEL)+protein+from+the+plasma+membrane+to+the+endoplasmic+reticulum:+studies+with+cholera+toxin+in+Vero+cells.">Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells.</a> J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).</li><li>Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reporter+Assay+to+Identify+Cellular+Components+of+Ricin+Toxin+A+Chain+Trafficking.">Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking.</a> Toxins (Basel). 8 (12), (2016).</li><li>Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+depurination+is+not+sufficient+for+ricin-mediated+cell+death+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae.</a> Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).</li><li>Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ricin:+structure,+mode+of+action,+and+some+current+applications.">Ricin: structure, mode of action, and some current applications.</a> Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).</li><li>Becker, B., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+yeast+as+model+to+study+ricin+toxin+a+uptake+and+trafficking.">Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking.</a> Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).</li><li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells.">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li><li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels.">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.+1979.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979.</a> Biotechnology. 24, 145-149 (1992).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li><li>Vitetta, E. S., Yen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+properties+of+genetically+engineered+ricin+B+chain+lacking+galactose-binding+activity.">Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity.</a> Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).</li><li>Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+an+endoplasmic+reticulum+retrieval+sequence+to+ricin+A+chain+significantly+increases+its+cytotoxicity+to+mammalian+cells.">Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells.</a> J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).</li><li>Breslow, D. 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J., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kluyveromyces+lactis+zymocin+mode+of+action+is+linked+to+RNA+polymerase+II+function+via+Elongator.">Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator.</a> Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wenn Sie die oben genannten Protokoll durchführen, empfehlen wir die folgenden Vorschläge zu ein erfolgreiches Ergebnis des Experiments zu erreichen.
Für heterologe Proteinexpression ist es wichtig, die IPTG-Konzentration von 1 mM nicht überschreiten. IPTG Konzentrationen &#62; 1 mM zu hemmen, Promotor-induzierte RTA Ausdruck und führen zu geringeren Erträgen Toxin. Darüber hinaus sollten Zellen bei Temperaturen über 28 ° C zur Verhinderung Einbeziehung Körper Bildung, ineffiziente F...

Patienten mit Infektionen durch Toxin produzierenden Bakterien stellen eine schwere medizinische und finanzielle Belastung für jeden sozialen Gesundheitssystem, insbesondere, da effiziente therapeutische Behandlungen noch weitgehend fehlen. Entwicklung neue therapeutische Strategien, die komplexe Rausch-Mechanismen der medizinisch relevanten A / B Giftstoffe wie Cholera Toxin oder Shiga Toxin Rizin vollständig verstanden werden, auf molekularer Ebene basierend auf neuartige leistungsfähige Assays, die umgesetzt werden müssen.
In den letzten Jahren mehrere Studien versucht, analysieren, A / B Toxin Transport in Hefe und Säugerzellen mit Zeit- und kostenintensive Methoden wie radioaktive Toxin zu beschriften,1,2 sowie SiRNA-basierten Screening 3nähert. In einigen Fällen ist die Toxin Menschenhandel visualisierte in Vivo durch Fluoreszenz-Mikroskopie nach chemische und/oder genetische Kopplung der einzelnen Toxin Untereinheiten mit Fluorophore, Quantenpunkte oder fluoreszierende Proteine4,5gewesen. Leider, solche Änderungen führen oft zu inaktiv und/oder veränderten natürlichen Eigenschaften der Giftstoffe. Eine weitere elegante Möglichkeit, indirekt eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten ist die Verwendung von Reporter-Systeme auf Basis von Enzymen wie LacZ, Luciferase oder fluoreszierende Proteine (z. B. GFP oder Discosoma sp. rot fluoreszierenden Proteins () DsRed)).
In diesem Manuskript ist ein einfaches Protokoll beschrieben die zelluläre Komponenten für den intrazellulären Transport von extrazellulär angewandte RTA in S. Cerevisiaeidentifiziert. Dabei fungiert ein Fluoreszenz-Reporter-Plasmid enthält eine N-terminale ER-Import-Signal gefolgt von GFP als ein Protein-Biosynthese-Sensor, der indirekt RTA-vermittelten Protein Übersetzung Hemmung von GFP Fluoreszenzemission nach in-vivo misst Übersetzung6. RTA Endozytose oder intrazellulären Handel ist negativ (oder positiv) in eine bestimmte Hefe Löschung Mutante im Vergleich zu Wildtyp betroffen, so kann dies durch eine Erhöhung (oder Verringerung) GLP Fluoreszenz Emission6erkannt werden.
Bisher beschränkten sich alle Methoden analysieren RTA Transport in Hefezellen, den ER zum Zytosol Retro-Translokation Prozess der RTA. In solch ein künstliches System drückt sich RTA mit ein ER-Import-Signal von einem induzierbaren Promoter wiederum eine selbstmörderische Phänotyp1,7. Obwohl die Zelle binden B-Untereinheit Ricin ebenfalls in der Versuchsaufbau beschrieben in dieser Handschrift fehlt ist und somit vollständig nicht die natürliche Situation von Ricin Holotoxin Rausch8, Toxin-Transport aus dem Plasma repräsentiert Membran durch den Golgi Apparat in die Notaufnahme kann eng mit dieser neuartigen Assay nachgeahmt werden. Interessanterweise zeigen die vorläufigen Ergebnisse der Pilotstudie, dass die Handel Wege von RTA verwendet auffallende Ähnlichkeiten mit den Rausch-Route von Ricin Holotoxin offenbaren.
Zusammenfassend lässt sich sagen kann das beschriebene Verfahren verwendet werden, zu bestimmen, die spezifische Rolle der ausgewählten zelluläre Proteine im RTA Endozytose und des Handels in der Hefe. Darüber hinaus könnte diese Versuchsanordnung leicht andere Ribosom Inaktivierung Toxine produziert und abgesondert von verschiedenen Hefen und Bakterien-Spezies wie Zymocin oder Shiga Toxin angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial and yeast strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; BY4742 deletion mutants</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>whole collection</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids used in this protocol&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a&lt;sup&gt;(+) &lt;/sup&gt;(Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA&lt;sub&gt;(His6)&lt;/sub&gt;</td><td>Becker &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2016)&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>lytic enzyme for cell wall removal</td></tr><tr><td>LB broth medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>15 g agar was added for plate production</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Yeast drop-out mix supplemts without leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-raffinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE ruler prestained</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>protein ladder used for Western analysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material for RTA purification, desalting and reader measurements&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>old model, other models available</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>old model, not available anymore</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>Product is discontinued and replaced</td></tr><tr><td>HisTRAP HP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>HiTRAP desalting column</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart sterile filter</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0.2 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660 nm assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (optional)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>primary antibody; 1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>secondary antibody, 1:10,000 dilution</td></tr></tbody></table>

a simple fluorescence-based reporter assay to identify cellular components required for ricin toxin a chain (rta) trafficking in yeast

Bakterien- und Werk A / B Toxine nutzen die natürlichen Handel Wege in eukaryotischen Zellen, deren intrazellulären-Zielen in das Zytosol zu erreichen und letztlich töten. Solche A / B Toxine bestehen in der Regel von einer enzymatisch aktive Asubunit (z.B. Ricin Toxin (RTA)) und mindestens eine Zelle, die Bsubunit(s), die verantwortlich sind für Toxin Bindung an bestimmte Oberfläche Rezeptoren Zelle binden. Unseren derzeitigen Kenntnissen wie A / B-Toxine sind in der Lage, effizient berauschenden Zellen half Wissenschaftler um grundlegenden zellulären Mechanismen wie Endozytose und intrazelluläre Protein Sortierung in höhere eukaryotische Zellen zu verstehen. Aus medizinischer Sicht ist es ebenso wichtig, die großen Toxin Handelsrouten, angemessene Behandlungslösungen für Patienten zu finden oder entwickeln schließlich therapeutische Toxin-basierten Anwendungen für die Krebstherapie zu identifizieren.
Seit genomweite Analysen von A / B Toxin in Säugetierzellen Menschenhandel ist komplex, zeitaufwändig und teuer, mehrere Studien an A / B Toxin Transport bei Modellorganismus der Hefe Saccharomyces Cerevisiaedurchgeführt wurden. Obwohl Sie weniger komplex, grundlegende zelluläre Prozesse in Hefe und höhere eukaryotische Zellen sind ähnlich und sehr häufig Ergebnisse, die in der Hefe die Säugetier-Situation übertragbar auf.
Hier beschreiben wir einen schnell und einfach zu bedienen-Reporter Assay zur Analyse der intrazellulären Handel mit RTA in der Hefe. Ein wesentlicher Vorteil des neuen Tests ist die Möglichkeit, nicht nur RTA Retro-Translokation aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytosol zu untersuchen, aber eher Endozytose und retrograde Toxin transport von der Plasmamembran in der Notaufnahme. Der Test nutzt ein Reporter Plasmid, die indirekte Messung der RTA Toxizität durch Fluoreszenzemission von das grün fluoreszierende Protein (GFP) kann nach der in-Vivo -Übersetzung. Da RTA effizient die Einleitung der Protein-Biosynthese von 28 s rRNA Depurinierung verhindert, ermöglicht dieser Assay die Identifikation von Host Zellproteinen intrazellulären RTA-Beförderung durch die Erkennung von Veränderungen in Fluoreszenzemission.

Die allgemeine Workflow des Protokolls beschrieben in diesem Manuskript wird in Abbildung 1, etwa fasst die einzelnen Schritte zur erfolgreichen RTA-Reinigung und das anschließende GFP Reporter Assay Experiment veranschaulicht. Eine ausführlichere Beschreibung jedes einzelnen Schritts finden Sie im Protokoll. Abbildung 2 zeigt das erwartete Ergebnis des erfolgreichen RTA Reinigung durch Affinitätschromatographie (<strong class...

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A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe

In der Handschrift beschreiben wir die Verwendung eines Hefe-basierte Fluoreszenz Reporter Assays, zelluläre Komponenten des Menschenhandels beteiligt und Tötung Prozesse von der zytotoxischen eine Untereinheit der Pflanze Toxin Rizin (RTA) zu identifizieren.

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

a-simple-fluorescence-based-reporter-assay-to-identify-cellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

7.9K Aufrufe.  Saarland University. In der Handschrift beschreiben wir die Verwendung eines Hefe-basierte Fluoreszenz Reporter Assays, zelluläre Komponenten des Menschenhandels beteiligt und Tötung Prozesse von der zytotoxischen eine Untereinheit der Pflanze Toxin Rizin (RTA) zu identifizieren.

Serie: A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Ein schnelles Verfahren für die Visualisierung von Live-immobilisierten Hefezellen

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Forschung

Biologie

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

Im lebenden Organismus Überwachung der transkriptionellen Aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter in Hefe

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Genetik

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Immunologie und Infektion

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe

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