Diese Arbeit wurde von NIH CA109821 (, TCC) unterstützt. Wir danken Beckman Coulter für die großzügige Bereitstellung von Mitteln zur Deckung der Veröffentlichungskosten und für technische Unterstützung bei der Einrichtung und Bedienung des Sammelnetzwerk Systems. Wir danken Dr. Fred Falkenburg für die Bereitstellung von ursprünglichen primären aller Kulturen.

Hinweis: dieses Protokoll wurde optimiert für primäre B-ALL die reichen im Durchmesser von ca. 8 µm (G1-Phase) bis 13 µm (G2/M-Phase) Zellen. Somit können die spezifische Zentrifuge Geschwindigkeiten und Pumpe Flussraten nicht auf Zellen mit verschiedenen Größenbereiche anwendbar. Allerdings können entsprechende Sammelnetzwerk Parameter unter Verwendung der Sedimentation Rate Gleichung geschätzt werden. Zellen sind wie beschrieben 16 auf eine optimale Dichte von 1-3 x 10 6 Zellen/mL in einem definierten serumfreien Medium kultiviert. Mit Ausnahme der Sammlung von Brüchen, bei 4 ° C mit Eis gekühlt Röhren durchgeführt wird, werden alle Schritte durchgeführt, bei Raumtemperatur und die Zentrifuge gesetzt bei 20 ° C mit maximal 24 ° c
 1. Vorbereitung der Sammelnetzwerk Puffer und Materialien <ol><li>zur Verklumpung der Zellen zu verringern, bereiten Sie einen Sammelnetzwerk Puffer von Hank &#39; s mit Phenol rot ergänzt mit 2 % fötalen Rinderserum (Kochsalzlösung (HBSS) ausgeglichen FBS), zum Schutz der Zellen vor mechanischer Belastung während der Sammelnetzwerk Prozess und 1,6 g/L 2-Naphthol-6,8-Disulfonic Säure Dipotassium Salz (NDA), das macht die Zelle außen negativ geladen und reduziert die Verklumpung.
	<ol><li>Eine 50 mL konische Rohr 1,6 g der NDA hinzufügen.</li>
		<li>35 mL HBSS aus eine 1 L Flasche, die 50 mL konische Röhrchen mit NDA unter sterilen Bedingungen hinzufügen. Das Rohr zu schwenken, bis die NDA aufgelöst hat.</li>
		<li>Mit einem 0,2 µm-Filter, die gelöste NDA in eine neue sterile 50 mL konische Rohr übertragen. Fügen Sie dann die NDA zu den verbleibenden 1 L HBSS.</li>
		<li>Schließlich 21 mL FBS hinzufügen HBSS, eine Endkonzentration von 2 % (V/V) zu erhalten. 
		Hinweis: Die Sammelnetzwerk Puffer kann vorbereitet und bei 4 ° C gelagert werden, bis zum Ablaufdatum auf der HBSS oder bis gibt es eine große Veränderung in der pH-Wert durch eine Gelbfärbung der Indikatorfarbstoff.</li>
	</ol></li> <li>Label 50 mL konische Rohre für die Sammlung der Fraktionen, so dass gibt es Röhren mit der Bezeichnung 1 und 2 (W1 und W2), Brüche 1-20 (F1 - F20) zu waschen und zu stoppen.
	<ol><li>Pre-chill diese Rohre auf dem Eis vor der Erhebung Brüche.</li>
	</ol></li></ol> 2. Montage des Systems Elutriation <ol><li>zuerst installieren die Strobe-Versammlung in der Zentrifuge, so, dass das Netzkabel aus der Kammer durch den Hafen auf der linken Seite zugeführt wird. Sicherstellen Sie, dass die Strobe-Blitzlampe an der Vorderseite der Kammer, ist so es mit Sichtfenster Line-up wird geschlossenem Zentrifuge.
	<ol><li>Die Versammlung im Ort zu sichern, indem Sie zuerst anziehen 2 Kreuzschlitz Schrauben in die zwei Löcher am oberen Rand jeder Bügel und dann durch Anziehen der Rändelschrauben am unteren Rand jeder Bügel.</li>
		<li>Stecken Sie das Netzkabel in die Strobe-Netzanschluss auf der Rückseite der Zentrifuge.</li>
	</ol></li> <li>Als nächstes absetzen den Rotor direkt auf der Zentrifuge Antrieb Nabe und sichern Sie mit einem T-Griff Inbusschlüssel. 
	Hinweis: Wenn die Zentrifuge nicht Sammelnetzwerk Zwecken nicht erforderlich ist, die Strobe-Versammlung und der Rotor können gehalten werden in der Zentrifuge zwischen Läufen.</li>
	<li>Sobald der Rotor gesichert ist, legen Sie die Quick-Release-Baugruppe mit der Sammelnetzwerk Kammer, Gegengewicht, Dichtungs-Baugruppe und Montageplatte in den Rotor drehen.
	<ol><li>Drücken Sie gleichmäßig mit einer Hand am Sammelnetzwerk und andererseits an das Gegengewicht bis der Bolzen in den Rotor in die Löcher auf der Montageplatte einrasten.</li>
		<li>Schließen Sie abschließend das verankern Kabel indem die Pin auf der einen Seite des Kabels in das Loch in der rotierenden Dichtungs-Baugruppe und Sicherung der Türspion auf der anderen Seite des Kabels mit einem Kreuzschlitz Schrauben (erwähnt in 2.1.1) an der Halterung an der linken Seite die Kammer f.</li>
	</ol></li> <li>Als nächstes montieren die Flow-System mit einem drehzahlgeregelten Pumpe und Schlauch zu Pumpe Puffer in der Sammelnetzwerk Kammer und Puffer zu sammeln, wie es aus der Sammelnetzwerk Kammer fließt.
	<ol><li>Einsatz der Größe 16 Eingang Schlauch aus der drehzahlgeregelten Pumpe über den Anschluss an die Spitze der Zentrifuge Kammer, links so dass es in die Kammer eintritt.</li>
		<li>Legen eine passende auf das freie Ende der Eingabe Schlauch und Armatur in der Eingabe Loch an der Seite der rotierenden Dichtungs-Baugruppe einfügen.</li>
		Legen Sie die Größe 16 Ausgang Schlauch durch den Hafen und hängen Sie es an das Übertragungsrohr an der Spitze des rotierenden <li>Dichtung Montage. 
		Hinweis: Die Flow-System kann auch montiert zwischen Sammelnetzwerk Läufe bleiben.</li>
	</ol></li> <li>Zu guter Letzt Einschalten die Zentrifuge und die Spezifikationen für das Experiment.
	<ol><li>Änderung der Rotor ID.</li>
		<li>Wenn die Zentrifuge ein Zeitaufwand erfordert, festgelegt für 2 h, was mehr als ausreichend, um eine Sammelnetzwerk laufen zu vervollständigen ist.</li>
		<li>Stellen Sie die Temperatur auf 20 ° C mit einer max. Temp von 24 ° c</li>
		<li>Legen Sie die Beschleunigung für Max und die Verzögerung für langsam.</li>
		<li>Schließlich stellen Sie die Geschwindigkeit bis 867 X g.</li>
	</ol></li></ol> 3. Grundierung der Sammelnetzwerk System <ol><li>zuerst um das Sammelnetzwerk System zu sterilisieren, legen die Reservoir-Schlauch in einer 500 mL Kunststoff-Flasche mit 5 % Bleichmittel und den Ausgang Schlauch in eine leere 1 L-Kunststoff-Abfall-Flasche.
	<ol><li>Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 25 mL/min und ermöglichen das 5 % Bleichmittel zu ganzen Weg durch das Sammelnetzwerk System fließen, bis es aus dem Ausgabe-Rohr in die Abfallflasche gepumpt wird.</li>
		<li>Die Zentrifuge einschalten und warten sie, um die maximale Geschwindigkeit (867 X g) bezeichnet, um Luftblasen und Gegendruck freizusetzen.</li>
		<li>Stoppen die Zentrifuge. Wenn der Rotor nicht rotiert mehr, den Deckel öffnen und inspizieren die Kammer für alle undichten Stellen.</li>
		<li>Gibt es keine Lecks, lassen Sie das Bleichmittel-Lösung fließen durch das System für mindestens 5 min.</li>
	</ol></li> <li>Als nächstes das Spülsystem mit autoklaviert Wasser als Bleichmittel zu Bildung von Ausscheidungen aus dem Puffer Sammelnetzwerk, die kann zur Verklumpung der Zellen führen führen kann, sowie Schäden an den Zellen verursachen.
	<ol><li>Ort der Reservoir-Schlauch in eine 1 L Flasche autoklaviert Wasser und lassen Sie es für mindestens 10 Minuten durch Spülen</li>
	</ol></li> <li>Nach dem Spülen mit Wasser, Sammelnetzwerk Puffer in das System einführen. Verwenden Sie eine 150 mL Glasflasche autoklaviert erstelle ich ein Reservoir für die Sammelnetzwerk Puffer und Zellen wurde.
	<ol><li>Die Flasche 100 mL Sammelnetzwerk Puffer hinzu und verschieben Sie das Reservoir Schlauch zur Glasflasche, so dass die Röhren an der Unterseite.</li>
		<li>Die Zentrifuge starten und lassen Sie den Puffer durch das System zu spülen, das Wasser fließen.</li>
		<li>Sobald die Vorratsflasche fast leer ist und das Wasser wird vollständig aus dem System heraus gespült, bewegen die Ausgabe Schläuche aus der Abfallflasche zum Stausee, dass der Puffer durch das System wiederverwertet wird.</li>
	</ol></li> <li>Schließlich das Sichtfenster so einstellen, dass die aktuelle Geschwindigkeit die Sammelnetzwerk Kammer eingesehen werden kann.
	<ol><li>Presse die Strobe Lampe / aus-Taste an der Außenseite der Zentrifuge so dass die Lampe einschaltet. Drehen Sie die Sammelnetzwerk kNob auch auf der Außenseite der Zentrifuge ganz nach links.</li>
		<li>Während langsam durch das Sichtfenster auf der Suche Drehen der Regler nach rechts, bis die Sammelnetzwerk Kammer in Sicht und das Blitzlicht kommt rechtzeitig mit der Drehung des Rotors ist. 
		Hinweis: Das Sammelnetzwerk System kann gelassen werden in diesem Zustand bis die Zellen desinfiziert werden.</li>
	</ol></li></ol> 4. Vorbereitung der die Zellprobe <ol><li>Anzahl Zellen und aliquoten 300 bis 400 Millionen im Wachstumsmedium in mehreren 50 mL konische Röhrchen. Spin-down der Zellen bei 1210 X g für 3 min.</li>
	<li>Aspirat aus Wachstum Medien und Aufschwemmen Zellen in 25 mL Sammelnetzwerk Puffer durch sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Verringerung des Zell-Verklumpung, Pass Zellen zweimal durch eine 25 gauge Nadel.
	<ol><li>Mit einer 10 mL Spritze zeichnen die Zellen und dann 25 Gauge-Nadel befestigen und die Zellen durch auf der Innenseite Wand einer sterilen 50 mL konische Röhre. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle 25 mL die Nadel durchlaufen haben.</li>
		<li>Erhalten eine neue Nadel und Spritze und wiederholen Sie den Vorgang oben einmal. 
		Achtung: Spritze Nadeln sollten in Sharps Container platziert werden. 
		Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zellen durch die Nadel geschoben, sind unmittelbar vor der Einführung in das Sammelnetzwerk System um Zelle Verklumpung auf ein Minimum.</li>
	</ol></li></ol> 5. Einführung der Zellprobe in das Elutriation System und Sammlung der Fraktionen <ol><li>Einführung in das Sammelnetzwerk System durch Gießen die Zellprobe in dem Behälter mit den restlichen Sammelnetzwerk Puffer recycling durch die Zellprobe .
	<ol><li>Lassen Sie die Zellen in das System eingeben und erreichen Gleichgewicht innerhalb der Kammer Sammelnetzwerk. 
		Hinweis: Dieser Vorgang dauert ca. 5 min. und Fortschritt kann durch die Beobachtung der Zellen beim Eintritt in der Kammers über das Sichtfenster verfolgt werden. Um sicherzustellen, dass alle Zellen in der Kammer, nimm einen Tropfen des Elutionsmittels, legen Sie auf einen Objektträger und unter dem Mikroskop betrachten. Wenn die Probe frei von intakten Zellen, dies bestätigt ihre Aufbewahrung in der Kammer.</li>
	</ol></li> <li>Fraktionen sammeln, sobald alle Zellen in die Kammer getreten und es eine deutliche Grenze an der breitesten Stelle der Kammer gibt, in dem die Zellen im Gleichgewicht sind.
	<ol><li>Beginnen indem das Ausgabe-Rohr auf die 50 mL konische Röhrchen beschriftet W1. Sammeln Sie 50 mL Sammelnetzwerk Puffer für dieser Bruch, achten Sie darauf, halten ein Auge auf den Vorratsbehälter und mit Sammelnetzwerk Puffer bei Bedarf auffüllen. 
		Hinweis: Um sicherzustellen, dass alle Zellen in das System eingegeben haben, können Sie der Behälter fast leer werden vor dem Nachfüllen des Stausees zum ersten Mal. Nach dem ersten Nachfüllen werden nicht nötig zu warten, bis der Behälter fast leer zu. Auch nicht immer erlauben den Tank leer werden, da diese Bläschen und Gegendruck im System anlegen wird.</li>
		<li>Sobald 50 mL für W1 gesammelt worden, gleichzeitig ändern Sie die Geschwindigkeit auf 821 X g und bewegen das Ausgabe-Rohr mit dem konischen Rohr beschriftet W2 und sammeln Sie mehr im selben Tempo 50 mL.</li>
		<li>Weiter Änderung der Geschwindigkeit und Brüche zu sammeln, wie in Tabelle 1 angegeben. Stellen Sie sicher, es gibt Medien in das Reservoir tank und behalten Sie stets die konischen Rohren auf Eis. Schließlich stellen Sie das Sichtfenster durch langsames Drehen der Regler nach rechts, da die Geschwindigkeit abnimmt.</li>
		<li>Einmal alle 20 Fraktionen gesammelt worden, die Zentrifuge zu stoppen und sammeln Sie 50 mL in der konischen Röhre mit der Aufschrift STOP.</li>
	</ol></li></ol> 6. Spülen der Elutriation System <ol><li>, nachdem die Zentrifuge das System vollständig bündig aufgehört hat, indem man die Reservoir-Schlauch in der 1 L Wasserflasche autoklaviert und den Ausgang Schlauch zurück in die Abfallflasche.
	<ol><li>Die Pumpendrehzahl bis 50 mL/min drehen und lassen Sie das Wasser durch das System laufen lassen, bis dieses aufgebraucht ist.</li>
	</ol></li> <li>Schalten Sie die Pumpe den Eingangs- und Schlauch vom Schnellspanner Montage entfernen, und ziehen Sie den Stift aus der Verankerung Kabel.
	<ol><li>Schnellverschluss-Versammlung vom Rotor entfernen. 
		Hinweis: Je nachdem, was die Zentrifuge für verwendet, kann das Sammelnetzwerk-System nun so belassen werden. Andernfalls kann die ganze Versammlung in umgekehrter Reihenfolge abgebaut werden wie oben beschrieben. Die Sammelnetzwerk Kammer kann aus der Schnellspanner Montage entfernt und zwischen den Läufen mit einem Ultraschall Wasserbad gereinigt. Dies entfernt Schmutz und Verunreinigungen aus der Kammerwand die späteren Auflagen negativ beeinflussen kann.</li>
	</ol></li></ol> 7. Analyse der Fraktionen und Sammlung der G1 oder G2/M Pools.
 Hinweis: um die Wirksamkeit des Sammelnetzwerk zu demonstrieren, wird jede Fraktion für Zellzahl, Zelle Durchmesser und DNA-Gehalt analysiert und Pools sind Zellen in G1 oder G2/M Phasen für Immunoblot Analysen erstellt, wie in beschrieben Vertreter Ergebnisse. Dieses Protokoll Abschnitt wird beschrieben, wie Sie erstellen diese Pools und bereiten sie für Versuchszwecke.
<ol><li>Spin jede Fraktion bei 2000 X g für 5 min bei 4 ° C und Aspirat aus Sammelnetzwerk Puffer.</li>
	<li>Mähdrescher Fraktionen zusammen, um ein G1-Phase-Pool und einen G2/M-Phasen-Pool zu erhalten.
	<ol><li>Für G1 phase Pool, Brüche, die im Drehzahlbereich von 788 X g 661 X g (F1 - F5) gesammelt wurden insgesamt 1 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) und Übertragung auf eine 15 mL konische Rohr Aufschwemmen. Für die G2/M-Phasen-Pool Aufschwemmen Brüche die im Drehzahlbereich von 387 x g und 333 X g (F17 - F20) gesammelt wurden.</li>
		<li>Spin-down Zellen 2000 X g für 5 min bei 4 ° C und Absaugen von PBS.</li>
	</ol></li> <li>Zellen in 10 mL Wachstumsmedien Aufschwemmen und nehmen eine Zellzahl.</li>
	<li>Eine Aliquote aus jedem Pool für DNA analysiert werden Inhalte über Propidium Jodid Färbung nehmen und fließen durchflusszytometrischen Analyse 15. 
	Hinweis: Der Rest der einzelnen Pools kann für weitere Experimente verwendet werden.</li>
</ol>

<ol>
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Anisha Kothari liegt derzeit bei der Abteilung für Zell- und Molekularbiologie an der St. Jude Children Research Hospital.

Wir haben einer Methode für den Erhalt der primären alle Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus mit CCE beschrieben. Unter optimalen Bedingungen eine im wesentlichen reine Bevölkerung der Zellen in der G1-Phase und eine hoch angereicherten Population von Zellen in der G2/M-Phasen könnte ohne weiteres eingeholt werden hervorragende Ausbeute und Zellen hochangereichertes in S-Phase können auch erhalten werden, wenn gewünscht. Die hier präsentierten Ergebnisse wurden mit eine eigenständige Kultur, ALL-2<s...

Kultivierte Zellen wachsen in der Regel asynchron und Einzelzellen sind in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Einige Organismen weisen natürlich synchronen Zelle Zyklen oder durch bestimmte physiologische Reize synchronisiert werden können. Zum Beispiel teilen Kerne in riesigen Plasmodien von Slime Mold Physarum Polycephalum in einem sehr synchron Mode1und Zellen der grünen Algen, die Desmodesmus Quadricauda synchronisiert werden kann, durch den Wechsel von hellen und dunklen Perioden2. Während solche Organismen einzigartige experimentelle Attribute bieten, modellieren sie unzureichend die Komplexität von Säugerzellen. Die Möglichkeit, künstlich Säugetier-Zellenbevölkerungen synchronisieren wurde zentraler Bedeutung für unser Verständnis der Zellzyklus-Verordnung und die molekulare Basis der Zellzyklus Checkpoints voranzutreiben. Gängige Methoden gehören Serum Entbehrung, chemische Block- und Veröffentlichung oder Nutzung von physikalischen Eigenschaften3,4. Rücknahme von Serum führt oft Zellen geben Sie Ruhe, und die erneute Zugabe von Serum fördert Wiedereintritt der Zellzyklus in der G1-Phase5. Chemische Inhibitoren gehören Stoffe wie überschüssige Thymidin oder Hydroxyurea die Zellen an der G1/S-Grenze zu blockieren oder Mikrotubuli-Inhibitoren die Zellen in der M Phase3,4in der Regel zu verhaften. Ansätze, die physikalische Eigenschaften ausnutzen gehören mitotischen Shake-off die bereichern für mitotischen Zellen verwendet werden kann, da sie weniger Anhänger als Interphase Zellen6sind. Alle diese Techniken haben jedoch mögliche Nachteile. Zum Beispiel pflegen nicht alle Zelltypen Lebensfähigkeit in der Abwesenheit von Serum oder das Vorhandensein von chemischen Inhibitoren und die Ausbeute an Zellen nach mitotischen Shake-off ohne vorherige Synchronisation mit mitotischen Inhibitoren beschränkt.
Mit Ausnahme der frühen embryonalen Zelle Zyklen, wo Zellen nach und nach in der Größe zurückgehen, da sie7teilen, die meisten Zellen durch den Zyklus Wachstumsphasen zu unterziehen und größer geworden. Diese Eigenschaft wird in der Technik der Gegenstrom zentrifugale Sammelnetzwerk (CCE) ausgenutzt, die kann verwendet werden, um Zellen unterschiedlicher Größe zu trennen und somit im Zellzyklus phase8,9. Während der CCE, Zellen werden unter dem Einfluss der beiden gegensätzlichen Kräfte: Zentrifugalkraft, die die Zellen von der Drehachse antreibt, und Fluidgeschwindigkeit (Gegenstrom), die die Zellen in Richtung der Drehachse (Abbildung 1) antreibt. Zellen in der Sammelnetzwerk Kammer erreichen eine Gleichgewichtslage, wo diese Kräfte gleich sind. Die wichtigsten Faktoren diktiert die Gleichgewichtslage sind Zelle Durchmesser und Dichte. Als der Fluss der Pufferlösung erhöht und die Widerstandskraft der Gegenstrom überwiegt die Fliehkraft, ein neues Gleichgewicht entsteht, verursacht eine Änderung in der Position der Zellen im Inneren der Kammer. Alle Zellen sind die Kammer-Ausgang, was zu kleineren verlassen die Kammer zunächst, während die größeren Zellen innerhalb der Kammer bleiben, bis die Gegenstrom-Rate ausreichend erhöht wird, um die Ausfahrt zu fördern verschoben. Die Flucht der Sammelnetzwerk Kammer mit aufeinander folgenden Erhöhungen Gegenstrom Zellen können in bestimmten Fraktionen gesammelt und jede Fraktion enthält Zellen nacheinander Größen zu erhöhen. Statt Sammelnetzwerk mit inkrementellen Erhöhungen Gegenstrom, werden fortlaufende Rückgang der Zentrifugalkraft durch Zentrifugation Geschwindigkeit verringern das gleiche Ergebnis erreichen. Der Prozess der Sammelnetzwerk erfordert Optimierung je nach Zelltyp, Sammelnetzwerk Puffer eingesetzt und das spezifische Gerät verwendet. Die Rate der Sedimentation der Zellen unter diesen Bedingungen wird am besten durch Stokes Gesetz beschrieben: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2R, wo SV = Sedimentation Geschwindigkeit; d = Durchmesser des Teilchens; Ρp = Dichte des Teilchens; Ρm = Dichte des Puffers; Η = Viskosität des Puffers; Ω = Winkelgeschwindigkeit des Rotors; und R = radiale Position des Partikels. So, SV ist proportional zur Zelle Durchmesser und Dichte, und da Durchmesser auf die zweite Kraft angehoben, es leistet mehr als Dichte, die in der Regel konstant durch den Zellzyklus ist.
Ein wichtiger Vorteil der CCE ist, dass Zellen nicht einer rauen chemische Behandlung oder ernährungsphysiologischen Entbehrung unterliegen und hervorragende Ausbeute im wesentlichen unbeirrt zurückgewonnen werden. Voraussetzung ist, dass die fraglichen Zellen eine deutliche Zunahme der Durchmesser von mindestens 30 % zu unterziehen, wie sie den Zellzyklus durchqueren. Der größte Nachteil sind die Kosten der spezialisierten Zentrifuge, Rotor und Zubehör. Dennoch hat die Fähigkeit, Zellen in bestimmten Zellzyklus Phasen von CCE bereichert bereiten Zellzyklus Forschung in Organismen aus Hefe auf Säugerzellen9,10erheblich erleichtert. Darüber hinaus sind die jüngsten Fortschritte verwendet zur Trennung von Zellen von gesunden versus Krebsgewebe, die Trennung der verschiedenen Zelltypen in heterogenen Gemischen und zur Produktion von bestimmten Zelltypen für Immuntherapie9erweitert.
Unser Hauptinteresse ist für das Verständnis des Wirkmechanismus von Mikrotubuli targeting Agents (MTAs) wie Vinca Alkaloide und Taxane gewesen. Diese Medikamente wurden gedacht, um ausschließlich in Mitose, blockieren Spindel Mikrotubuli Funktion11,12, handeln, aber den letzten Beweis schlägt vor, dass sie auch Interphase Microtubules13,14Zielen können. Wir berichteten kürzlich, dass primäre akute lymphoblastische Leukämie (ALL) Zellen Tod entweder der G1-Phase unterziehen oder in der M phase, wenn mit Vincristin und anderen MTAs im Zellzyklus-abhängigen Weise15behandelt. Die Fähigkeit, alle Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen von CCE zu trennen war maßgeblich an dieser Schlussfolgerung. In diesem Artikel wir beschreiben die technischen Details und bieten praktische Tipps für die Anwendung des CCE zur Vorbereitung des primären alle Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen.

<table><tbody><tr><td>Hanks&#039; balanced salt solution</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>1 L bottle</td></tr><tr><td>Fetal Plus bovine serum</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>500 mL bottle</td></tr><tr><td>2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g powder</td></tr><tr><td>50 mL concial tubes</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/case</td></tr><tr><td>PES Membrane 0.22 &amp;micro;m filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/pack</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>centrifuge compatible with elutriation system</td></tr><tr><td>JE 5.0 elutriator rotor kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>356900</td><td>rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly</td></tr><tr><td>Chamber, standard, 4-mL, &quot;A&quot;</td><td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>standard elutriation chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Variable-Speed Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1.5 Precision Glide needle</td><td>BD</td><td>305127</td><td>sterile, single-use needles</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td>sterile, single-use syringes</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase staining buffer</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>propidium iodide/RNase staining buffer</td></tr><tr><td>cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate</td><td>BioRad</td><td>170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation

Die Fähigkeit, Zellen zu synchronisieren ist zentraler Bedeutung für unser Verständnis des Zellzyklus Verordnung gewesen. Gemeinsame Techniken umfassen Serum Entbehrung; Chemikalien, die Zellen in verschiedene Zellzyklus Phasen zu verhaften; oder die Verwendung der mitotischen Shake-off die Einhaltung der reduzierten nutzt. Jedoch haben alle diese Nachteile. Zum Beispiel arbeitet Serum Hunger gut für normale Zellen aber weniger gut für Tumorzellen mit kompromittierten Zellzyklus Checkpoints aufgrund Onkogen-Aktivierung oder Tumor-Suppressor-Verlust. Ebenso können chemisch behandelte Zellpopulationen Hafen Medikamenten-induzierten Schäden und stressbedingten Veränderungen zeigen. Eine Technik, die diese Probleme umgeht ist Gegenstrom zentrifugale Sammelnetzwerk (CCE), wo Zellen ausgesetzt sind zwei gegensätzliche Kräfte, Fliehkraft und Fluidgeschwindigkeit, wodurch die Trennung der Zellen auf der Grundlage von Größe und Dichte. Da Zellen, die Förderung durch den Zyklus in der Regel vergrößern, einsetzbar CCE Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen. Hier wenden wir diese Technik auf primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen. Unter optimalen Bedingungen erhalten Sie eine im wesentlichen reine Bevölkerung der Zellen in der G1-Phase und eine hoch angereicherten Population von Zellen in der G2/M-Phasen hervorragende Ausbeute. Dieser Zellpopulationen eignen sich ideal für Studium Zellzyklus-abhängige Mechanismen der Wirkung von Krebsmedikamenten und für andere Anwendungen. Wir zeigen, wie Änderungen an der standard-Verfahren kann in suboptimalen Leistung führen und die Grenzen der Technik zu diskutieren. Die detaillierte Methodik vorgestellt sollte Anwendung und Erforschung der Technik auf andere Arten von Zellen erleichtern.

Primäre alle Zellen (3-4 x 108) gesammelt in zwei Fraktionen waschen und zwanzig Hauptfraktionen, wie im Protokoll beschrieben und zentrifugale Sammelnetzwerk ausgesetzt waren. Tabelle 1 zeigt repräsentative Daten wo die Gesamtzahl der Zellen in jeder Fraktion sowie die entsprechenden Rotordrehzahl vorgestellt werden. Alles in allem war die Ausbeute in der Regel über 80 %. Messung des Durchmessers der Zelle in einzelne Fraktionen bestätigt die Zelle Durchmesser erhöht sich...

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Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.2K Aufrufe.  University of Arkansas for Medical Sciences. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.

Serie: Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Forschung

Krebsforschung

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant cellular localization disrupting their mechanism of action. The survival of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells, among other cancer cells, is assisted by the deregulation of nuclear to cytoplasmic shuttling, at least in part through deregulation of the transport receptor XPO1 and the constitutive activation of PI3K-mediated signaling pathways. It is essential to understand the role of individual proteins in the context of their intracellular location to gain a deeper understanding of the role of such proteins in the pathobiology of the disease. Furthermore, identifying processes that underlie cell stimulation and the mechanism of action of specific pharmacological inhibitors, in the context of subcellular protein trafficking, will provide a more comprehensive understanding of the mechanism of action. The protocol described here enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These fractions can be used to determine changes in protein trafficking between the nuclear and cytoplasmic fractions upon cell stimulation and drug treatment. The data can be quantified and presented in parallel with immunofluorescent images, thus providing robust and quantifiable data.

This protocol enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These samples are used to determine protein localization as well as changes in protein trafficking that take place between the nuclear and cytoplasmic compartments upon cell stimulation and drug treatment.

Subzelluläre Fraktionierung der primären chronischen lymphatischen Leukämiezellen zur Überwachung des nuklearen/zytoplasmatischen Proteinhandels

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Medizin

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Immunologie und Infektion

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modeling Chemotherapie beständig Leukämie<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Biologie

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Subcellular Fractions from Leukemic Cells: A Method to Generate Cellular and Nuclear Fractions from Leukemic Cells

Source: Hay, J., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/60426">Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the preparation of subcellular fractions from leukemic cells which is a method to generate cellular and nuclear fractions from leukemic cells. The nuclear and cytoplasmic fractions can be used for further downstream analysis.

Präparation subzellulärer Fraktionen aus leukämischen Zellen: Eine Methode zur Erzeugung zellulärer und nukleärer Fraktionen aus leukämischen Zellen

Source: Hay, J., et al. Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Leukemia

In vitro techniques & assays

Density Gradient Centrifugation: A Method to Isolate CLL Cells from Peripheral Blood

Source: Hay, J. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/60426">Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of isolating chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells from peripheral blood. With this protocol, we will isolate CLL cells from human patient blood sample for subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions.

Dichtegradientenzentrifugation: Eine Methode zur Isolierung von CLL-Zellen aus peripherem Blut

Source: Hay, J. et al. Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking. J. Vis. ...

Cell isolation & characterization

Leukemic Subpopulation Harvest: A Method for Spatial Separation of Leukemic Cell Subpopulations from 2D Co-culture

Source: Slone, W. L., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/53645">Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a method for spatial separation of three leukemic cell subpopulations: the suspended leukemic cells freely floating in the media, phase bright leukemic cells adhered to the surface of the mesenchymal stromal cell monolayer, and the phase dim leukemic cells that have migrated beneath the mesenchymal stromal cell monolayer from 2D co-culture.

Leukämische Subpopulationsernte: Eine Methode zur räumlichen Trennung von leukämischen Zellsubpopulationen aus 2D-Cokulturen

Source: Slone, W. L., et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a method for spatial separation ...